奧林巴斯熒光蛋白的顏色調色板的技術發(fā)展

已在過去幾年，特征熒光發(fā)射譜線，跨越幾乎整個可見光譜范圍廣泛的熒光蛋白基因變異。在原始的水母蛋白廣泛誘變努力造成新的熒光探針，顏色從藍色到黃色范圍和是Zui廣泛使用的體內的一些記者的分子生物學研究。長波長的熒光蛋白，發(fā)光的橙色和紅色的光譜區(qū)域，已從海洋海葵Discosoma 芨和礁珊瑚屬于珊瑚蟲綱。仍已開采其他物種產生類似蛋白質有青色、 綠色、 黃色、 橙色、 紅色和遠紅光的熒光發(fā)射。正在進行開發(fā)研究努力提高亮度和穩(wěn)定性的熒光蛋白，從而提高他們的整體效用。

基本在范圍廣泛的迄今為止發(fā)現的熒光蛋白質譜差異的理解是熒光的結構性調查的立體化學性質和熒光性能及其周圍環(huán)境的影響。除了水母蛋白質，似乎紅移的熒光蛋白的熒光分子變異程度高。甚至通過紅色熒光熒光配置，稱為的平面獨聯(lián)體，似乎是在發(fā)出橙色和紅色區(qū)域的大多數蛋白質的主要結構，有至少兩個額外的圖案、平面反式和非平面反式，這被闡明通過 x 射線衍射研究。平面反式母題在紅色熒光蛋白 eqFP611，Entacmaea quadricolor，其中顯示了一個Zui大的斯托克斯從分離轉移和紅移的發(fā)射波長配置文件任何自然發(fā)生的珊瑚蟲熒光蛋白的發(fā)現。相比之下，非平面反式構象是種從Montipora efflorescens?Rtms5非熒光色素蛋白的特性。新的 mFruit 蛋白，如下文所述的幾個特征明顯偏離嚴格平面幾何的不尋常的生色團體系結構。

近幾年的基本起源和操縱的熒光蛋白發(fā)光顏色出現了大量的指導的圖案。Zui重要的考慮似乎是的 p 軌道共軛內發(fā)色團，它很大程度上決定了一般譜類 （如青色、 綠色、 黃色或紅色） 所載的物理范圍。此外，當地的環(huán)境變量，如帶電的氨基酸殘基、 氫接合網絡和疏水相互作用蛋白基質內的位置有能力生產藍色或紅色光譜位移在吸收和發(fā)射極大值的多達 20 毫微米。作為進一步研究復雜特性的熒光蛋白生色團出產量與多肽骨架的結構-功能關系有關的線索，基因工程更微妙的顏色變形和擴大的有用的蛋白質光譜范圍的任務將無疑成為更容易。

圖 1 所示是各種熒光蛋白融合標簽特定亞艙室的本地化。增強型藍色熒光蛋白 （接骨） 嵌合體和靶向序列從亞基八人細胞色素 c 氧化酶組蛋白的定位于線粒體 （圖 1(a)) 體外培養(yǎng)的人體細胞，同時類似融合了 mCerulean （藍綠色的熒光蛋白） 和人類β-肌動蛋白突出了絲狀肌動蛋白細胞骨架網絡 （圖 1(b)) 在非洲綠猴成纖維細胞中。經典和Zui常用的熒光標簽，增強型綠色熒光蛋白 （EGFP） 構成一個類似的細胞骨架網絡時與alpha配對-微管蛋白 （圖 1(c)) 和黃色變種 (EYFP) 可以融合在 N-末端 81 氨基酸的人類β-1，4-轉移進行本地化了黃色綠色熒光標記到高爾基 (圖執(zhí)行。粘著斑成為熒光與望月的 mKusabira 橙色熒光蛋白 （人民圣戰(zhàn)者組織；圖 1(e)) 和紐蛋白在狐貍肺成纖維細胞與單體紅色熒光蛋白 mCherry 凸顯的核和濃縮的染色體融合到組蛋白 H2B （圖 1(f)) 在人宮頸癌細胞。

藍色熒光蛋白

熒光蛋白發(fā)光的可見光的光譜 （大約 440 到 470 納米） 的藍色區(qū)域第一次得到的定點突變努力針對酪氨酸氨基酸殘基中 GFP 生色團 66 位置 （見圖 2）。這個殘留到組氨酸 (Y66H) 轉換產生藍色熒光蛋白的 (BFP)，展品廣泛吸收波段在中心 380 納米和排放量Zui高，在 448 納米的紫外線。原蛋白表現出只有大約 15 到 20%的父 GFP 亮度值低的量子產率和所需額外的二次突變增加其折疊的效率和表達水平。隨后進行的調查和幾個額外的突變導致了一個增強的 BFP 版本，是增強綠色變種一樣明亮，仍只有 25%，并將許多其他熒光蛋白顯示有限的光穩(wěn)定性比較。

在 1990 年代中期到后期發(fā)展藍色熒光蛋白的主要動機是創(chuàng)建配對熒光共振能量轉移 （煩惱） 實驗和多色標簽都甚感興趣。因為 BFP 的光譜特性 （熒光發(fā)射配置文件） 是很容易區(qū)分綠色熒光蛋白，這種蛋白質組合是第一次用于多色成像之一。藍色熒光蛋白也有的被納入第一基因編碼傳感器和增強綠色熒光蛋白變體，通過聯(lián)動兩種熒光蛋白質通過干預蛋白酶敏感的間隔的演示 FRET 的區(qū)別。BFP 廣泛排放峰值的重疊與激發(fā)光譜的紅移的綠色熒光蛋白變異產量 4.1，一個合理的值，測量 FRET 斯特距離很大程度上。藍色熒光蛋白也伴隨著幾種綠色熒光蛋白衍生物入旨在監(jiān)視轉錄因子的二聚化，鈣和細胞凋亡的生物傳感器。

除了有限的亮度水平和快速漂白，藍色熒光蛋白也患有的事實他們一定會興奮與紫外線的照射，是光毒性對哺乳動物細胞中，即使在有限的劑量。此外，在這個光譜區(qū)域工作經常受到自體熒光和細胞和組織，以及光散射的高吸收水平。顯微鏡經營在紫外線也需要專門的光源、 光學和更復雜的成像的篩選器組合。所有上面列出的原因，尋求更有效的藍色熒光蛋白的只有所追尋的幾個研究組。調查使用定位和周圍發(fā)色團的非天然氨基酸的突變導致了幾個藍移"人造的"熒光蛋白變異，可能會發(fā)現在幾個生物和光物理應用程序的實用程序。

圖 2 中所示是對于顏色的變體綠色熒光蛋白的生色團結構。在所有情況下，成熟的發(fā)色團的第一步是一系列的搬遷位置 65 氨基酸的羧基碳，使它是在接近的接近度對氨基氮的甘氨酸殘留在位置 67 (Gly67) 的多肽骨干的扭轉調整。酰胺態(tài)氮的甘氨酸，其次是脫水的這個碳原子的親核進攻結果唑啉-5-酮雜環(huán)體系的形成。芳香族氨基酸 （位置 66） 碳鍵分子氧氧化延伸的咪唑啉環(huán)系統(tǒng)，包括芳香取代基的電子共軛時發(fā)生熒光。在以下各節(jié)中更詳細地討論了青色、 綠色和黃色的熒光蛋白變異生色團。

藍綠色熒光蛋白

第一次發(fā)射在藍綠色青色譜區(qū) （CFP； 從大約 470 至 500 毫微米） 聯(lián)合王國熒光蛋白時發(fā)現了同時與 BFP 轉換酪氨酸殘留在 GFP 生色團為色氨酸 （Y66W） 的誘變研究。這種單一的突變產生了一個發(fā)色團，具有非常廣泛的熒光發(fā)射的譜線，輪廓中心在 485 納米在 436 納米顯示吸收Zui大值。后續(xù)的改進，包括F64L成熟改進和S65T?(綠色熒光蛋白節(jié)中討論），導致更大的亮度和光穩(wěn)定性生產的增強版本 （后； 見圖 2）。然而，即使這些修改未能增加后超出 40%的綠色熒光蛋白所顯示的亮度水平。多色成像提供額外的色相后的Zui有前途方面Zui初是作為生物傳感器 FRET 的伙伴的黃色熒光蛋白質，視場和使用藍色紫羅蘭色過濾器集合或 457 納米光譜線的氬離子激光共聚焦顯微鏡實用的潛力。更大的光穩(wěn)定性相比接骨也定位后作為更多有用的蛋白質的延時成像在本地化和動力學的研究。

到目前為止Zui為成功的應用使用后已利用了這種變體被加上黃色熒光蛋白 （YFP） 和衍生工具來生成 FRET 傳感器能夠監(jiān)測廣泛的細胞內的過程 （見圖 3） 的能力。雖然使用后 EYFP 對進行了 FRET 調查的主機，但實驗結果亦經常有問題由于限制到一個小的動態(tài)范圍測量熒光性能的限制。在大多數的這些生物傳感器在 FRET 分析中，除了少數例外陳列 10 到 30%的典型總體比例的變化。這種較低的對比度與現代數碼顯微鏡可以接近 10%的低成像強度信號的噪聲水平的困難。這些生物傳感器進一步變得復雜時具有如在膜中存在的那些緊二維空間限制的約束，形成二聚體的潛力。為了克服與二聚體相關聯(lián)的工件，疏水性殘留在二聚體界面替換為正電氨基酸在后和 EYFP 產生真正單體的變種 （mCFP 和 mYFP），而達到更高水平的 FRET 實驗效率。臨界突變是性能的賴氨酸對丙氨酸在位置 206 （A206K），可以適用于幾乎任何水母維多利亞變?yōu)榱松烧鎸嵉膯误w能力的優(yōu)越在應用程序中定位，別發(fā)愁和蛋白質動力學等取代。

盡管在 CFP 的改進主機和實驗用這種變體的大型數據庫，繼續(xù)的調查產生了額外有用的熒光蛋白質中的青色的光譜類。之間的改進青色熒光蛋白質Zui近被介紹了，CyPet 和增強的青色變體稱為蔚藍顯示Zui有發(fā)展前景作為融合標簽，FRET 傳感器和多色成像 （見圖 1、 3 和 11）。蔚藍的熒光探針 （天藍色的顏色命名） 是合理地設計通過定點突變增強型藍綠色熒光蛋白，產量較高的消光系數、 改進的量子產率和具有單個指數組件 （在生存期衰減測量的煩惱中有用） 熒光壽命衰減。蔚藍是至少 2 倍亮度比增強型藍綠色熒光蛋白，已經被證實可以顯著提高對比度，以及信號對噪聲比黃色發(fā)光的熒光蛋白質，例如金星（下面討論），再加上在 FRET 調查中。除了旨在提高折疊和亮度的定點突變，對預蔚藍的變種進一步增加的摩爾消光系數，進行了隨機突變和優(yōu)化的蛋白質已被"monomerized"來提高其效用的融合。豐富的天藍色所提供的優(yōu)勢特征呈現這種蛋白質的Zui有用的萬能青色導數。

藍綠色熒光蛋白變體被稱為CyPet?（的首字母縮寫：?Cy熒光P水相的電子能量轉運） 推導了通過定量的和獨特的戰(zhàn)略，利用熒光激活細胞分選加強的青色和黃色搭配的煩惱。請注意，在設計中探針的 FRET 調查，捐助量子產率和承兌人的消光系數，以及的重疊積分這些變量之間的優(yōu)化是實現提高的效率的Zui重要參數之一。圖書館的 CFP 和 YFP 的變種被篩選 FRET 效率，為Zui佳的無性系受到幾個進化周期隨機突變和合成 DNA 改組技術組成。共有 7 個突變導致在生產中的 CyPet 蛋白，特征吸收和發(fā)射極大值將出現在定位 435 和 477 納米，分別。CyPet 是關于明亮如 EGFP 和三分之二一樣明亮蔚藍，但表示在攝氏 37 度相對較差的一半。然而，當其流式細胞儀優(yōu)化合作伙伴，YPet，在 FRET 生物傳感器，搭配這個青色變形陳列是 CFP YFP，顯著提高了對比度，并有可能導致更為敏感檢測細胞內過程、 微妙的六倍以上的動態(tài)范圍。CyPet 具有比 mCFP，大大增加了多色成像，其效用，是當前可用的弱二聚體和單體版本的大多數基質青色熒光蛋白質更藍移和較窄的熒光發(fā)射峰。

幾種可能有用青色蛋白質被隔離在珊瑚蟲的物種。來自礁珊瑚Anemonia majano，?AmCyan1熒光蛋白，現在是商業(yè)上可用的 （減），進行了優(yōu)化與人類密碼子的表達增強哺乳動物細胞系統(tǒng)中。Zui初命名的amFP486(我，?Anemonia majano；FP、 熒光蛋白 ；486排放Zui大） 設計以簡化討論無數珊瑚蟲蛋白質命名計劃，根據這個變形陳列類似的亮度水平，但明顯更好的耐光漂白到比 CFP。AmCyan1 的吸收Zui大熒光發(fā)射峰位于 489 納米時發(fā)生在 458 納米。請注意這兩個峰向長波長由轉移 19 和 13 個納米，分別，相對于后。缺點是，類似于大部分的其他礁珊瑚蛋白質，該探頭具有形式四聚體，這會變得更加復雜的企圖雇用這種蛋白作為一個融合標簽或共振生物傳感器的傾向。

首次分離脅和從Acropara石珊瑚物種的同伙，青色發(fā)光Midori 伊青色（縮寫為MiCy） 探針Zui初被設計為單體 Kusabira 橙色 （人民圣戰(zhàn)者組織） 熒光蛋白新 FRET 結合捐助來生成具有高光譜重疊的生物傳感器探頭 （斯特距離的 5.3 ； 見圖 4 ； 人民圣戰(zhàn)者組織在橙熒光蛋白上節(jié)中討論）。這種蛋白質功能的Zui長的吸收和發(fā)射波長配置文件 (472 和 495 納米，分別） 任何探測器中的青色的光譜類報道。高摩爾消光系數、 量子產率展出由 MiCy 呈現天藍色，同等亮度的蛋白質譜雖遠更敏感的 ph 值。也類似于蔚藍，MiCy 功能單一指數一生衰變 3.4 納秒，時間常數元件，應該有用 FRET 相結合測量與熒光壽命成像顯微鏡 （電影）。MiCy 的一個不尋常的特點是它形成了復雜的類似于分離的生物發(fā)光海堇的綠色熒光蛋白變體，雷尼利亞胡蘿卜，而不是強制的四聚體中觀察到大多數珊瑚礁物種同源。雖然二聚化主題可能是一些融合蛋白的一個問題，它應該比 MiCy 變成真正的單體的四聚體容易得多。

Zui近，一個新單體青色熒光蛋白具有優(yōu)越的亮度，對酸性條件下和光穩(wěn)定性不敏感推出了為活細胞成像應用的融合伙伴，和作為 FRET 捐助者為黃色和橙色的受體熒光蛋白在生物傳感器中。被稱為mTFP1?（單體藍綠色熒光蛋白 1），備選案文生產從圍繞 tetrameric 青色蛋白，?cFP484，源自Clavularia軟珊瑚合成基因庫。顯示紅移譜線輪廓 （激發(fā)和發(fā)射性能極大值在 462 和 492 納米，分別） 時與其他青色此類成員的光譜相比，mTFP1 有 31 氨基酸替換與野生型四聚體的共。紅移光譜被認為當分類的新顏色為藍綠色，而不是青色。不同于其他成員的青色熒光蛋白組的一般功能位置 66 中發(fā)色團的芳香族氨基酸色氨酸，mTFP1 包含古典酪氨酸殘留在這個位置，許多 GFP 衍生品的特點。代以色氨酸酪氨酸減少廣泛的熒光發(fā)射譜線寬度從約 60 納米窄并更易于管理的 30 納米，是有用的減少的一個因素流血，通過在多色彩的實驗。MTFP1 高量子產率 (0.85) 作為擁有超過 5.0 時黃色或橙色的熒光蛋白結合斯特距離 FRET 捐助者提供青色衍生物、 mCFP 和 mCerulean，很好的替代。

圖 4 中所示是的吸收和發(fā)射譜線，以及 MiCy 和人民圣戰(zhàn)者組織和推薦帶通濾波器的勵磁和 FRET 分析使用兩個探針的熒光發(fā)射的聚會。MiCy 發(fā)射譜和吸收譜的人民圣戰(zhàn)者組織之間的重疊區(qū)域提出了一種帶有灰色填充，同時激發(fā)和發(fā)射譜流血，通過區(qū)域顯示為紅色和藍色填充，分別。應用激勵帶通濾波器以 440 納米 21 納米帶寬為中心的水平降低的人民圣戰(zhàn)者組織，激發(fā)和 495 20 納米排放過濾器可以分析的無污染的信號向承兌人 （人民圣戰(zhàn)者組織) 捐助排放 （MiCy） 熒光。565 20 納米承兌人帶通濾波器包含的Zui高排放地區(qū)的人民圣戰(zhàn)者組織大約 7-10%流血，通過 MiCy 信號。有切對波長為 485 納米 (不說明) 二向色鏡應利用與此篩選器組合。

綠色熒光蛋白

原始的綠色熒光蛋白分離的水母維多利亞（被稱為野生型） 一直是眾多調查的主體，但不是在大多數涉及熒光蛋白質，由于雙峰吸收帶 (395 和 475 納米的山峰），阻礙了相對較低的消光系數和居住在光譜的紫外線部分主要吸收Zui大值的實際應用中有用。不久 GFP 被證明是有效的標記基因表達后，改變絲氨酸殘基中發(fā)色團成蘇氨酸 (S65T) 位置 65 點突變產生的蛋白質具有定義良好的吸水剖面呈單峰在 484 納米的新版本。這種突變被推薦的Zui受歡迎的變異型綠色熒光蛋白，稱為增強型綠色熒光蛋白 （EGFP），可以將通?？捎玫暮Y選器集設計用于熒光素 （FITC） 成像，是Zui聰明和Zui基質的水母維多利亞熒光蛋白質。這些功能提供了增強型綠色熒光蛋白的Zui受歡迎的探針和Zui好的選擇之一為大多數單標簽活細胞熒光成像實驗。正如以前討論 EGFP 的藍色熒光蛋白質作為 FRET 受體在早期生物傳感器調查中，再加上，但其后被黃色、 橙色和紅色的變異很大程度上取代。利用綠色熒光蛋白作為一個融合標簽到唯一的缺點是對 ph 值和催化的弱趨勢略有敏感性。

EGFP，除了活細胞成像實驗中目前所利用的幾種其他綠色發(fā)光二極管變異 （大約 500 到 525 納米的范圍）。其中Zui好的這些的光穩(wěn)定性和亮度可能是翡翠變種，但商業(yè)源 （直到Zui近） 的缺乏限制了它的使用。翡翠包含在綠色熒光蛋白，推薦的S65T突變，但也有提高折疊，表達在 37 攝氏度左右和亮度的四個額外的點突變。雖然翡翠是遠比 EGFP 在折疊和發(fā)展在哺乳動物細胞中的熒光更為有效，它有可能會影響定量成像在某些環(huán)境中的快速光漂白組件。WtGFP Zui有趣衍生物之一是藍寶石，其中包含一個臨界突變的異亮氨酸蘇氨酸市場位置 203 （T203I），廢除在 475 納米的吸收峰。其結果是一種蛋白質吸收Zui大值在 399 納米與排放在綠色光譜區(qū)域 （511 納米），產量大得驚人的斯托克斯位移超過 100 納米。幾個藍寶石變種已提高折疊，包括T 藍寶石（用于渦輪增壓)，設有圓形排列的衍生產品，并可被稱為一個探測器，對于改變方向幾何與融合伙伴可能很有用。吸收和發(fā)射峰之間重大分裂，藍寶石蛋白質的Zui大潛力是其配對與橙色和紅色衍生品 （見圖 8） 作為 FRET 捐助者。

種類繁多的額外熒光蛋白質發(fā)光的綠色光譜區(qū)域已從其他來源，包括不同的水母物種、 橈足類及珊瑚礁分離。Zui有前途的這些探頭，導出了隨機突變的分離從水母 coerulescens，無色蛋白之一被稱為aceGFP。谷氨酸轉化為甘氨酸在 222 （E222G） 的位置與光譜剖面，剖面有吸收Zui大值在 480 納米和發(fā)射峰在 505 納米一相對對稱雙轉化為高度熒光的物種野生型 aceGFP 蛋白。AceGFP 高的摩爾消光系數、 量子產率相結合，產生類似于由 EGFP 顯示的亮度水平。作為一種單體在水溶液中存在的表明電泳和凝膠過濾，這種蛋白質是商業(yè)上可用從幾個來源 （減和 Evrogen，?AcGFP1和AceGFP，分別） 人力資源優(yōu)化密碼子的替代。正確定位的融合產品針對特定的亞細胞組分和細胞器 (如絲狀肌動蛋白、 高爾基體、 細胞核和線粒體 ； 見圖 1） 指示那 aceGFP 是作為標記很有用，可以 FRET 組合新穎有紅色發(fā)光蛋白與伙伴關系的潛力。然而，aceGFP 的光穩(wěn)定性特點仍然是未知的并且有使用這種蛋白質超過更常見的綠色熒光蛋白和翡翠變種沒有明顯優(yōu)勢。

熒光蛋白屬性

表 1

在表 1 中給出了是由幾個Zui受歡迎和Zui有用的熒光蛋白變體顯示的屬性編輯。與常見的名稱和/或每個熒光蛋白的首字母縮寫，一起列出了峰值吸收和發(fā)射波長 （給出納米）、 摩爾消光系數、 量子產率、 相對亮度和體內結構協(xié)會。計算的亮度值從的摩爾消光系數、 量子產率，產品出來，除以 EGFP 百分率來計算的表中記錄的值。這個清單從科學和商業(yè)文獻資源創(chuàng)建的并不是要全面，但相反表示熒光蛋白衍生物，在文獻中受到相當重視，可能證明是有價值的研究工作。此外，吸收和熒光發(fā)射譜表中列出并說明了在這次審查錄在受控條件下和歸一化的比較和顯示唯一的目的。在實際的熒光顯微鏡調查中，譜線輪廓和波長極大值，可能會受環(huán)境的影響，如 ph 值、 離子濃度和溶劑的極性以及本地化的探針濃度的波動發(fā)生變化。因此，上市公司的消光系數、 量子產率可能不同于實際觀察到的實驗條件下的。

幾個密切相關的綠色熒光蛋白樣蛋白已分離出各式各樣的橈足類水生甲殼類動物物種。Zui明亮的這些探頭，Zui初被稱為ppluGFP2，取得了商業(yè)上可用的 （Evrogen） 下CopGFP和TurboGFP?（增強變量) 的名稱。CopGFP 有效地激發(fā)使用氬離子激光或 FITC 藍色勵磁篩選器設置 （吸收Zui大值在 482 納米） 和產生綠色熒光在同一個亮度值 502 納米大約 30%高于 EGFP 和更大的阻力，對 ph 值的變化。據報單體在稀溶液中，CopGFP 比 EGFP 快得多的成熟，是理想的應用程序作為融合伙伴針對高酸度在亞細胞區(qū)域中的表達。這種探頭的局限性包括無法分離出穩(wěn)定的細胞系和集料在長期的文化的形成。改進的版本，TurboGFP，來自定點和隨機突變，在亮度和極大地降低電阻與酸性環(huán)境保留父蛋白與損失輕微的快速成熟動力學。盡管改進折疊動力學和優(yōu)異的光學性能，這些蛋白的然而，光穩(wěn)定性數據未見報道，沒有令人信服的證據存在，表明廣泛地研究了原始綠色熒光蛋白衍生物的應用相比，一個顯著的好處。

綠色熒光蛋白也已開采從礁珊瑚和這些有幾個是商業(yè)上可用。明亮熒光蛋白稱為考醫(yī)學院綠色，軸承只驚奇地很少 （小于 6%） 序列的同源性為綠色熒光蛋白，是從石珊瑚Galaxeidae分離和已經被證實可以迅速成熟期間在哺乳動物細胞中的表達。同樣，從Zoanthus的原始珊瑚蟲珊瑚礁蛋白質之一由 Matz 報告和工友也變成一種商業(yè)產品 (減) 下的ZsGreen。探針在 492 和 496 納米吸收Zui大值和發(fā)射峰在 505、 506 納米，分別有，欣然允許可視化和標準激光與篩選器組合在共焦成像和視場顯微鏡。然而，類似于大部分的其他蛋白質分離在珊瑚、 考醫(yī)學院綠色和 ZsGreen 兩者都作為四聚體中的自然狀態(tài)，明顯會干擾他們的使用作為融合伙伴和 FRET 捐助或承兌人在生物傳感器中的存在?？朔S機突變與齊聚反應問題，定點努力是成功的在創(chuàng)造一個單體版本的綠色的但這種類型的努力不被舉報 ZsGreen 雖然蛋白質已經重新設計與人類密碼子優(yōu)化表達式 （導致一個稱為ZsGreen1的變種）。因為缺乏可靠的光穩(wěn)定性數據，尚不清楚是否要么這些蛋白質在長期成像實驗中表現將綠色熒光蛋白。

海三色堇，珊瑚蟲的軟珊瑚，是幾個綠色熒光蛋白的特點是，在細節(jié)和市面上現在的來源。從海腎胡蘿卜，展品屬性類似于綠色熒光蛋白分離蛋白是Zui好的特點在此類中的探頭。具有吸收和發(fā)射極大值在 485 和 508 納米，分別，除了一種類似對 ph 值、 敏感的海腎蛋白將 EGFP 的理想替代如果不是它是專性的二聚體的事實。除了齊聚反應的問題，海腎兩性可能有用在許多應用中，已經表示出種類繁多的生物，包括細菌、 真菌和哺乳動物細胞。版本與人類密碼子序列是可用來自廠家，是金融衍生品的在其他物種中的表達進行了優(yōu)化。那里是普遍缺乏可靠的數據關于消光系數、 量子產率和商業(yè)的雷尼利亞蛋白質，光穩(wěn)定性，所以有效的比較對 EGFP 的亮度和光漂白是不可能。

綠色熒光蛋白和其衍生品的Zui有用和Zui流行的活細胞成像應用之一正在后漂白 （FRAP） 設計實驗，以研究細胞內動力學熒光恢復中的一個標記。圖 5 (a) 所示是用綠色熒光蛋白標記的上皮細胞融合到內質網針對本地化到此細胞器網絡熒光探針的序列。感興趣區(qū)域的 （紅框） 追溯與聲光可調諧濾光器 （AOTF） 在激光掃描共聚焦顯微鏡，和該地區(qū)然后是與高激光功率 photobleached 5 秒鐘 （圖 5(b))，有效淬火所有的熒光。繼續(xù)監(jiān)測的單元格與成像激光 (488 納米氬離子） 在低強度多長的時間段 （幾分鐘到一個小時） 使可視化熒光恢復在 photobleached 地區(qū) （數字披露和 5(d))。情節(jié)的熒光強度與時間 （圖 5） 啟用恢復動力學的定量化分析，并提供有關信息的擴散系數和調動這熒光蛋白嵌合體。

黃色熒光蛋白

黃色的熒光蛋白，作為一個光譜的階級，是中Zui多才多藝的基因編碼探測器尚未開發(fā)。測距中發(fā)射波長極大值從大約 525 到 555 納米，這些蛋白質實際上居住在短波長區(qū)域顯示為綠色，而不是黃色的當在視場熒光顯微鏡中查看。什么已成為探針相當大家族中的第一個成員是綠色的合理工程后的高分辨率晶體結構熒光蛋白揭示的蘇氨酸殘留物 203 (Thr203) 綠色的位置附近發(fā)色團和潛在的能夠改變在替換時的光譜特性。為了誘使 π 軌道疊加和試圖穩(wěn)定的激發(fā)的態(tài)偶極矩的發(fā)色團介紹了，幾個芳香酯基這脂肪族氨基酸的突變。Zui成功的突變體被證明是酪氨酸 （T203Y； 稱為突變體10 C、 原始 YFP），導致幾乎 20 納米轉向向長波長的激發(fā)和發(fā)射光譜。在試圖使亮度以及增加的成熟速度和優(yōu)化表達式在攝氏 37 度Zui大化Zui初建造了幾個 YFP 變形。這些變種，命名為黃玉，之一已服務的融合標簽本地化、 胞內信號轉導，和 FRET 調查。

在努力提高 FRET 生物傳感器的性能，進一步的序列改進導致增強型黃色熒光蛋白 （EYFP），這是一種Zui明亮和Zui廣泛利用熒光蛋白的發(fā)展。EYFP 到位置 69 代替谷氨酰胺 （Q69K） 從原始的黃色變形構造由賴氨酸的介紹。高亮度水平和熒光發(fā)射光譜波長配置文件的 EYFP 結合起來，使這探針熒光顯微鏡、 多色成像實驗的優(yōu)秀候選雖然成熟較慢，尤其是在細胞器。增強的黃色熒光蛋白也廣泛采用作為能量轉移實驗時搭配增強型藍綠色熒光蛋白受體。然而，所有的原始的黃色熒光蛋白變異存在的一些問題，他們是非常敏感的酸性 pH，失去了大約 50%的 ph 值為 6.5 的熒光。此外，大部分的水母-也已證明在此類中的派生的蛋白質有重大敏感性到氯離子，經過弱的二聚化，比很多的綠色的熒光蛋白質更容易表現出相對較差的表達式，在攝氏 37 度，和 photobleach。幾個調查措施胞漿 ph 值、 氯離子濃度和 FRET 效率已經利用 YFP 的環(huán)境敏感性。A206K突變，代以帶電的氨基酸賴氨酸對丙氨酸疏水性二聚體界面，已應用于 YFP 以生成真實的單體。

YFP 家庭繼續(xù)遺傳發(fā)展導致發(fā)現附近發(fā)色團，替代的甲硫氨酸谷氨酰胺在位置 69 （Q69M），一個單一的點突變急劇增加蛋白的酸穩(wěn)定性并減少氯的敏感性。茶晶點名表揚的黃顏色和耐酸性，這種變體還表示在哺乳動物細胞培養(yǎng) （特別是當有針對性的對酸性細胞器） 更高的水平，并演示了幾乎兩倍的光穩(wěn)定性研究許多以前黃色熒光蛋白質。茶晶分別，特點在 516 和 529 納米，Zui大吸收光譜和熒光光譜發(fā)射值，雖然基質不是很亮綠色熒光蛋白，比 75%。FRET 傳感器用茶晶構造表現出更好的性能比姐姐類似物含有 EYFP 和探針一般是多色實驗更好的選擇。雖然茶晶存在作為一個弱的二聚體在溶液中，這種蛋白質可以轉化單體與 A206K 基因突變。

另一種新型的點突變引入水母-派生的 YFP，替代的亮氨酸苯丙氨酸在位置 46 （F46L），產生一個 variant 類型，被評為金星在夜空中Zui亮的星 （或星球） 的榮譽。這種突變，循環(huán)排列的綠色熒光蛋白衍生物的隨機突變實驗中發(fā)現了，大大加速了氧化的發(fā)色團，熒光蛋白成熟的速率限制步。額外的基因突變，還介紹了增加的酸性環(huán)境對金星的耐受性，減少對氯的敏感性。吸收和發(fā)射譜峰 (515 和 528 納米，分別） 的金星是轉移的時間更長波長相比 EYFP，單個納米，但保留的亮度水平。不幸的是，金星的光穩(wěn)定性研究只是大約 25%的 EYFP，長期成像的一個重大問題實驗。金星已經被證實可以執(zhí)行以及在細胞內細胞器融合蛋白 ph 值測定方法，定位研究酵母、 在雙分子熒光互補分析中，和著巨大的潛力作為承兌人在 FRET 的生物傳感器。弱二聚金星遺傳轉化為一種單體使用 A206K 突變將進一步擴大此探針在生物調查中的使用。

在同一熒光激活細胞分選帶領到藍綠色熒光蛋白 CyPet 的代的調查，期間進化優(yōu)化互補 FRET 承兌人，被稱為YPet，也被從金星和 YFP 的變種。YPet 的名字命名其精通 FRET (YFP為電子能量轉運），是Zui亮黃色的熒光蛋白變體尚未開發(fā)和演示很好的光穩(wěn)定性。YPet 所提供的酸性環(huán)境抗性優(yōu)于金星和其他 YFP 衍生品，將提高此探針在生物傳感器組合針對酸性細胞器中的效用。然而，雖然優(yōu)化的 CyPet YPet 組合應該是發(fā)展的新的共振生物傳感器中的首選的起始點，這對該實用程序已不尚未被廣泛在實踐中檢驗。同樣，CyPet 和 YPet 在融合標簽的定位實驗、 雙分子互補分析和其他常規(guī)熒光蛋白檢測方法的適用性尚未建立。這兩種蛋白質作為弱二聚體，在溶液中存在，但大概是可以轉換為真正的單體使用曾這么好與水母的其他變種 A206K 突變。

綠色和黃色的熒光蛋白被轉基因創(chuàng)建啟用融合到氨基酸遠遠脫離正常氨基和羧基總站 （縮寫為的cpGFP和cpYFP） 的原始序列的循環(huán)排列。保存較好的beta-筒體結構的熒光蛋白，耦合到由這些探頭，表現出復雜的翻譯后修飾生色團成熟模式乍表明主要插入到主多肽骨干會防止熒光。然而，幾個突變體制定了 （見圖 6），保險絲的原始羧基 (C) 和氨基酸 (N) 總站與短的間隔和創(chuàng)建新的客人蛋白融合的每桶結構內的位置。雖然對標準的熒光蛋白有點改變允許融合的性質和循環(huán)置換變形的屬性，這些新的設計提供一個獨特的機會，以生成本地化探頭和生理指標的原始類。

原 EYFP 分子被表示為一幅漫畫，畫在圖 6 (a) 以顯示與羧基和氨基總站表示為紅絲帶的黃桶。一種串聯(lián)融合產品的 EYFP 與另一種蛋白 （由一個紋理的球體表示） 圖解圖 6 (b)，在和 EYFP 插入一個拆分蛋白域所示圖即可得到。在總站搬遷到的一種蛋白質在原始的總站位置，隨后插入的每桶地區(qū)循環(huán)置換 EYFP 和減去插入蛋白相同的配置所示數字混亂和 6 (e)，分別。在圖 6 中的Zui后三個漫畫 ((f) (g) 和 (h)) 說明插入的一種融合蛋白在C-總站 (圖 6(f))、 拆分域的C和N總站的插入 （圖 6(g)) 和測試版的一個完整的蛋白質域插入-桶骨干 EYFP （圖 6(h))。在圖 6 中的第一次三個漫畫是標準的熒光蛋白嵌合體，而過去的 5 是隨時可以使用環(huán)狀排列的變形構造的可能性。

雖然潛在的其他水母維多利亞水螅蟲種類，黃色和綠色熒光蛋白的新發(fā)現是重要的只有一位候選人浮出水面為止。隔離的Phialidium水母，一種蛋白質稱為phiYFP據報道，證明非常明亮的黃色熒光 （吸收和發(fā)射在 525 和 537 納米，分別），并可用于 N-端融合標簽。PhiYFP 的一個非同尋常的特征是自然發(fā)生的蛋白質包含相同的突變位置 64 （亮氨酸），介紹了金星，增加了可折疊的效率。探頭自然也包含在位置 203，另一個網站針對修改本機的綠色熒光蛋白，導致黃色熒光的酪氨酸。這個驚人的發(fā)現，自然之間的 phiYFP 結構和轉基因的水母蛋白是相似性的蛋白質工程努力以 GFP 為目標，調整的光譜性質的療效的證明。PhiYFP 蛋白已被優(yōu)化，隨機突變產生一個單體的版本而不損害的光譜性質。

定點，單體的珊瑚蟲熒光蛋白從Discosoma?（mRFP1） 的隨機突變會導致在創(chuàng)作中兩個單體珊瑚礁衍生物與光譜特性在水母黃色熒光蛋白質的范圍下降。命名同樣色彩豐富的水果，?mHoneydew和mBanana這兩個發(fā)射熒光黃色的光譜區(qū)域。MHoneydew （峰在 487 和 504 納米） 的廣泛吸收帶，使有效的激勵與氬離子激光或標準 FITC 篩選器組合。然而，同樣是廣闊的發(fā)射譜 （峰 537 和 562 納米） 尾巴到近紅外，阻礙了這種蛋白質在多色實驗中使用。此外，低消光系數、 量子產率呈現 mHoneydew 單體黃色熒光蛋白干部的暗成員。MBanana 變量只是兩次明亮如 mHoneydew，但功能多窄激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 （的峰值 540 和 553 納米，分別）。因為這兩個蛋白表現出相對較差的光穩(wěn)定性和 mBanana 是高度 pH 敏感，既不可能會發(fā)現偉大的事業(yè)在成像的實驗。也許這些探頭的Zui有前途方面是僅僅的 mHoneydew （一個青色類型Y67W突變體） 存在演示基于色氨酸的生色團的 CFP 可以接受進一步成熟成發(fā)光波長較長的物種。

ZsYellow（原稱zFP538） 是一種黃色的熒光蛋白，在Zoanthus期間進行的搜索礁珊瑚為自然發(fā)生的綠色熒光蛋白類似物發(fā)光熒光在更長的波長區(qū)域的珊瑚蟲按鈕息肉被發(fā)現。ZsYellow 熒光發(fā)射光譜的Zui獨特的功能之一就是峰值 （538 納米） 幾乎中途發(fā)生那些 EGFP 之間 （508 納米） 和紅色熒光 （583 納米），提供了一個機遇探討蛋白質發(fā)光熒光在可見光的光譜中的黃色部分。ZsYellow 熒光蛋白生色團功能新穎的三環(huán)系統(tǒng)和肽骨干乳溝由于賴氨酸絲氨酸生色團三肽序列中的第一個氨基酸殘基作為替代。由于獨特的生色團的母題，在 ZsYellow 中觀察到程度是共軛的中間那用 EGFP 和紅色熒光 （一個雙鍵比綠色熒光蛋白，多） 和一個小于紅色熒光，觀察哪些帳戶為定位的發(fā)射波長在黃色區(qū)域之間。ZsYellow 陳列形式四聚體的明顯的傾向時表示在體內，阻礙了這種蛋白使用作為融合伙伴為定位的調查。此外，ZsYellow 與增強型綠色熒光蛋白 （EGFP 的 25%） 相比減少的亮度水平也限制了這是記者在熒光顯微鏡 （人類的密碼子優(yōu)化的版本是ZsYellow1作為商業(yè)上可用） 中的效用。然而，獨特的發(fā)射譜線輪廓的 ZsYellow，應該鼓勵尋找遺傳改變，同時要增加量子產率和消光系數，Zui終可能會產生高性能單體黃色熒光蛋白努力減輕形式四聚體的傾向。

提出了一種在圖 7 中是一幅拼貼畫的組蛋白 H2B 融合蛋白的證明廣大熒光蛋白顏色調色板的效用。每個嵌合體包含一個選定單體熒光蛋白序列 （mCerulean、 EGFP、 人民圣戰(zhàn)者組織，mCherry 和 mPlum） 融合到人類組蛋白 H2B，分離與中間鏈接器單位包含六個氨基酸組成的氨基酸序列。在圖 7 中的圖像收集，從瞬時轉染人子宮頸癌 (HeLa) 細胞后的表達的融合蛋白好幾天。細胞在不同階段的細胞有絲分裂中捕獲是明顯與所有嵌合體。雖然前期、 中期、 和后期分別描繪在面板 (b)、 (c) 和 (d)，間期是 （a） （水平方向），為所有的蛋白質在面板中說明。這些融合蛋白是有用的有絲分裂的調查，需要與其他熒光蛋白多色成像。廣泛的有用的熒光蛋白突變體圖 7，涵蓋了整個可見光譜范圍內 （見圖 10），提供了極大的靈活性在成像的合作伙伴的選擇。

橙色的熒光蛋白質

與熒光蛋白質工程中的青色、 綠色和黃色的光譜類的數目相對較大，只有三個探頭有迄今已開發(fā)的頻譜 （從約 555 到 580 納米） 的橙色部分中。即便如此，所有三個現有的橙色熒光蛋白，與被隔絕的珊瑚礁物種，都有可能在各種成像場景非常有用。也許Zui多才多藝的這些是單體的Kusabira 橙色，Zui初來自于蘑菇作為四聚體蛋白珊瑚石芝珊瑚黃果(在日語作為Kusabira 以示已知)。Kusabira 橙色是由定點誘變從 cDNA 克隆的珊瑚策劃通過向 N 端添加十個氨基酸。由此產生的蛋白質有吸收Zui大值在 548 納米 （理想為勵磁與 543 納米激光） 和發(fā)出明亮的橙色熒光在 561 毫微米。Kusabira 橙色 （縮寫為人民圣戰(zhàn)者組織） 單體版本是使用類似于所采用的紅色熒光，創(chuàng)建 mRFP1 （紅色熒光蛋白節(jié)中討論） 通過引入超過 20 通過定點和隨機誘變突變策略創(chuàng)建的。單體展品到四聚體類似光譜特性和有一個亮度值，類似于綠色熒光蛋白，但對酸性環(huán)境稍微更敏感。光穩(wěn)定性的這個探頭，然而，是Zui好的任何熒光蛋白在所有的光譜類，使人民圣戰(zhàn)者組織長期成像實驗是Zui佳選擇。此外，發(fā)射譜線輪廓足夠良好分離，青色的熒光蛋白來增加 FRET 效率在生物傳感器納入人民圣戰(zhàn)者組織中, 和探頭是有用的多色調查相結合的青色、 綠色、 黃色和紅色熒光蛋白 （見圖 4）。

MRFP1 衍生物，利器，推導出經過四輪的定向進化屈服在 548 納米吸收和發(fā)射橙色熒光在 562 納米探針。利器變是略微亮度比 mKusabira 橙色，但已經低于 10%的光穩(wěn)定性，因此嚴重損害及其應用實驗，需要重復的成像。然而，利器仍然是橙色的光譜分類中的Zui亮蛋白質和仍然是一個極好的選擇強度在哪里比長期光穩(wěn)定性更重要。此外，當結合綠色發(fā)光二極管的 T-藍寶石，利器是一個合適的替代 CFP YFP 蛋白質作為生成長波長傳感器 （圖 8），擔心對，可以加在其他光譜區(qū)域為多色調查熒光蛋白質。一種新型的橙色熒光蛋白質分離株Cerianthus管海葵是商業(yè)上可用 （商號cOFP；Stratagene） 和有類似于利器和橙色，mKusabira 的光譜特性，但像其他?？鞍踪|分離到目前為止，存在四聚體的解決方案中。亮度和光穩(wěn)定性的 cOFP 有不報道這種蛋白質不能與其他橙色的熒光蛋白，直接比較，其效用將進一步限制直到它可以被轉換成一種單體。

在圖 8 中，提出了一種作為 FRET 對藍寶石和利器的熒光蛋白的結合。說明有吸收和發(fā)射譜線的兩個探針和推薦帶通過濾器的勵磁和收集 FRET 分析的熒光發(fā)射。藍寶石的發(fā)射譜和吸收譜的利器之間的重疊區(qū)域提出了一種帶有灰色填充，同時激發(fā)和發(fā)射譜流血，通過區(qū)域顯示為紅色和藍色填充，分別。應用激勵帶通濾波器中心在 395 納米 30 納米帶寬減少或有效地消除了的利器，激勵水平和 512/26-納米排放過濾器可以分析的捐助熒光發(fā)射 （藍寶石） 無污染的信號向承兌人 （利器）。寬帶 600 80 納米承兌人篩選收集了大量的信號從低于 10%的利器流血，通過藍寶石熒光。有切對波長為 500 納米 (不說明) 二向色鏡應利用與此篩選器組合。

紅色熒光蛋白

乖巧的紅色發(fā)光熒光蛋白尋求長久以來"圣杯"的活細胞成像，主要是由于探針多色成像實驗，以及更長的激發(fā)波長產生較少的毒性和可以更為深入的探討生物組織的事實在這個光譜區(qū)域的要求。作為附加的便利，在紅色區(qū)域的可見光譜中的蛋白質大部分可以成像與常見TRITC和德克薩斯州紅視場熒光篩選器設置，以及一樣便宜氦-氖 (543、 561、 594 和 633 納米） 激光共聚焦顯微鏡在。經過五年的不成功的誘變努力在水母綠色熒光蛋白的蛋白質中，第一次真正的突破發(fā)生的潛在熒光 chromoproteins 在非生物發(fā)光的珊瑚蟲珊瑚物種中發(fā)現。到目前為止，廣泛的潛在的有用的紅色熒光蛋白質有報道 （跨 580 到 630 納米的發(fā)射波長范圍），其中許多至今仍受到一定程度的強制性的第四紀結構賦予他們的物種的起源。與水母蛋白質，不同的是大多數本機和轉基因的珊瑚礁蛋白變異體成熟非常有效地在 37 攝氏度左右，大概是因為它們各自的原棲息地的不同的水溫度。

第一次的珊瑚蟲衍生熒光蛋白被廣泛調查是從?？?strong>Discosoma 芨派生和Zui初被稱為drFP583，但現在通常被稱為紅色熒光。一旦這種蛋白質已經完全成熟了，紅色熒光的熒光發(fā)射譜的特點 583 納米高峰而激勵譜有一個主要的高峰在 558 納米和一名未成年人峰值約 500 納米。幾個問題都是在實踐中與紅色熒光關聯(lián)。成熟的紅色熒光熒光慢慢發(fā)生和收益通過中間生色團的舞臺在哪里的熒光發(fā)射多數被認為是在綠色區(qū)域。被稱為綠色狀態(tài)，此工件已證明具有挑戰(zhàn)性與其他綠色熒光蛋白的組合多個標記實驗由于光譜重疊。此外，DsRed 是專性的四聚體，以融合蛋白干擾不良特征構造，常常導致本地化質量不佳，和向窗體大蛋白聚集體在活細胞中的趨勢增加。雖然這些副作用不是重要的當探頭利用只是作為一名記者的基因表達，DsRed 作為抗原表位標記的效用是嚴重損害。大水母家族中已聘請，成功地標記數以百計的融合蛋白的蛋白質，與 DsRed 融合蛋白已經證明遠不那么成功和常表現出毒性作用。

紅色熒光熒光蛋白的主要問題的幾個已經通過定點和隨機誘變努力克服。第二代版本的紅色熒光，稱為DsRed2，包含一系列的無聲核苷酸替換對應人類密碼子偏好和增加的成熟率的幾個內部序列變異。此外，消除的基本氨基酸殘基 （改為酸性或中性基團） 的肽氨基 DsRed2 總站在融合構建窗體集料減少蛋白質的趨勢。DsRed2 蛋白仍然形成四聚體在解決方案中，但它是更符合綠色熒光蛋白在多個標記實驗中由于增加的成熟率。與第三代的紅色熒光的突變體，還顯示峰值細胞熒光增加的亮度水平，實現了成熟時間進一步減少。紅色熒光發(fā)射從DsRed 快遞（從減商業(yè)矢量） 可以在表達式中，而大約六個小時為 DsRed2 和 DsRed 11 個小時后小時內觀察。在表達紅色熒光綠色狀態(tài)的存在不是明顯，渲染這種熒光蛋白 tetrameric DsRed 變形為多個標記實驗的Zui佳選擇。因為這些探測器仍預留四聚體，然而，他們有很大程度上被替換與二聚體和單體的版本和現在歷史感興趣的只是。Zui近介紹了商業(yè)上可用的單體版本的 DsRed （減），但的固有亮度和光穩(wěn)定性的這種探頭都報道要貧窮。

在圖 9 中所示是三個Zui常見的生色團結構圖案，展出由珊瑚蟲礁珊瑚的熒光蛋白，包括 DsRed、 ZsYellow 和遠紅光eq611FP?(見下文)。紅色熒光生色團是與在本機的綠色熒光蛋白，發(fā)現類似的結構，但通過第二個骨干債券來擴展共軛的 π 電子系統(tǒng)，以包含肽鏈中的位置 （前面發(fā)色團） 65 的苯丙氨酸氨基酸殘基的氧化修改。此外，非同尋常的順式肽鍵的配置通過Phe65和Gln66，其中α的位置之間-谷氨酰胺殘留在相同的平面啉環(huán)系統(tǒng)，正好與其余的生色團 （請注意綠色熒光蛋白的特點在此位置正常反式構型） 碳原子。獨特獨聯(lián)體取向的紅色熒光熒光，通過晶體的衍射分析證實了，是由減少空間位阻、 增強的電子離域化和增加的氫鍵鍵合，與鄰近的氨基酸殘基穩(wěn)定。紅色熒光 （這是不存在的 GFP) 中的這種與眾不同的粘接配置存在暗示異構現象圍繞著這個債券可能在生色團成熟的關鍵一步。

據報綠色熒光發(fā)射瞬間發(fā)生在 ZsYellow 生色團 （圖 9） 時的酪氨酸α-β碳鍵分子氧氧化延伸的咪唑啉環(huán)系統(tǒng)，包括酪氨酸苯基環(huán)共軛和其段氧取代基 （類似于 GFP） 的形成。然而，分光鏡調查產生了綠色的物種由沒有前途的路線到一個不完整的熒光基團的產品，而不是真正的中間狀態(tài)形成的證據。短命 acylimine 基團的部分入手，形成黃色熒光的成熟序列，由終端氨基酸組Lys66?，形成了一個新型的部分不飽和的六元哌啶環(huán)，同時劈的多肽骨干 65 和 66 位置之間的攻擊。通過 x 射線衍射結構分析表明新型雜環(huán)系統(tǒng)位于與其余的 ZsYellow 色 （如圖 9 所示），大約平行的平面上的發(fā)現與提高發(fā)射波長的延長的共軛機理一致。此外，卵裂的殘留物Phe65和Lys66之間的肽骨干結果殘留 65，終端甲酰胺集團的形成，應該是可供參與氫鍵穩(wěn)定熒光基團。

大量的額外紅色熒光蛋白顯示相當多的承諾已從礁珊瑚生物分離。第一次被改編為哺乳動物細胞應用之一是HcRed1，這是從Heteractis 皺?？蟹蛛x和現在是商業(yè)上可用 （減和 Evrogen）。HcRed1 Zui初被來自非熒光色蛋白吸收的橙色光通過定點和隨機突變。六個氨基酸替換總共有必要創(chuàng)建一個紅色的熒光物種，成熟，迅速和有效地在攝氏 37 度 （吸收和發(fā)射在 588 和 618 納米，分別）。然而，類似于許多其他礁珊瑚蛋白質，產生紅色熒光 HcRed 顯示形成時表示在細菌中的預留四聚體的傾向。額外誘變的努力導致一個更光明的二聚體變形，但蛋白質單體版本尚未發(fā)現。為了生成一個物種在創(chuàng)建融合產品為定位研究非常有用的蛋白質，構造了串聯(lián)二聚體表達載體的 HcRed （兩個頭-尾相同副本的蛋白）。當融合到一個基因產物本身形成生物聚合物 （如肌動蛋白或微管蛋白），HcRed 串聯(lián)二聚體形成分子內締復雜 （模仿一個單體的標記），顯然不會干擾產生嵌合體的生物活性。然而，因為整體的亮度和光穩(wěn)定性的這結為姊妹蛋白相結合具有尚未得到改善，它仍然在活細胞顯微術的日常應用程序的次要選擇。

遠紅光的熒光蛋白，被稱為eqFP611?（圖 9），從分離海葵Entacmaea quadricolor?，顯示的Zui大的斯托克斯轉變和紅移的熒光發(fā)射波長配置文件之一 （激發(fā)和發(fā)射性能極大值在 559 和 611 納米，分別） 的任何自然發(fā)生的珊瑚蟲熒光蛋白。EqFP611 的量子產率和消光系數相結合，產量大約一樣明亮綠色熒光蛋白探針。在體內熒光成熟過程中，發(fā)生在大約 12 個小時，這種蛋白質穿過綠色的中間狀態(tài)。然而，成熟以后, 可以檢測只有一小部分的這個綠色的物種 （少于 1%）。與其他珊瑚蟲的熒光蛋白，eqFP611 有降低的趨勢，oligomerize 在低濃度下通過電泳法和單分子實驗，證明雖然濃度高，蛋白并形成四聚體。定點突變的努力產生了功能二聚體變異體的 eqFP611，和繼續(xù)的努力，Zui后可能會導致單體遠紅熒光蛋白從這一物種。

晶體學的研究表明，eqFP611 形式參展 222 的對稱性，這是類似于觀察到的密切相關的紅色熒光熒光蛋白，也非熒光色蛋白Rtms5的四聚體。然而，在β內-可以折疊，eqFP611 熒光采用獨特的共面配置在其中Try64苯氧基基團是定位的反式，而不是獨聯(lián)體（如紅色熒光 ； 見圖 9） 對咪唑啉環(huán)系統(tǒng)。此外，三循環(huán)環(huán)系統(tǒng)和其取代基，大概只有有限的流動性里面的蛋白，參與眾多氫鍵 （至少九個） 和各種非極性范德華力相互緊密相鄰的水分子和氨基酸殘基。擴展的疏水性蛋氨酸側鏈填充Zui終也是目前在 DsRed 和 Rtms5 的深口袋，熒光基團和鄰近的脂肪族的聯(lián)合的互動和芳香族氨基酸側鏈 （和水分子） 可能有助于闡明背后的不尋常的熒光性質的 eqFP611 蛋白的機理。

兩個額外礁珊瑚紅色熒光蛋白、?AsRed2和JRed，商業(yè)上可用 （減和 Evrogen），但這些探頭形式 tetrameric 和二聚體的配合物，分別是，和很少使用下面描述的單體蛋白質。AsRed2 Zui初作為被分離出來從Anemonia 蘇種色素蛋白，修改通過突變產生一種蛋白質，具有Zui大值在 576 納米吸收和發(fā)射峰在 595 納米與一個很謙虛的量子產量 （0.05）。雖然在哺乳動物細胞中的表達人類密碼子優(yōu)化了蛋白質，它陳列只有約 10 %egfp 和光穩(wěn)定性的亮度水平尚未見報道。通過廣泛誘變的水母種色素蛋白產生了新型的紅色熒光標記 584 和 610 納米，其峰值吸收和發(fā)射波長分別導出了二聚體蛋白，JRed。探測器已經被證實可以產生有用的融合標簽，但不適合在原核生物由于折疊問題中的表達。JRed 大約是 25%時照亮在 560 至 580 納米區(qū)域，但可以成功地用于長期的成像實驗，當興奮 543 納米激光一樣明亮 EGFP 和展品有限的光穩(wěn)定性。

真正的單體 DsRed 變種，以及蛋白質在其他珊瑚蟲的物種，從單體建筑已被證明是一個困難的任務。33 氨基酸改建 DsRed 序列共需為第一代單體紅色熒光蛋白的創(chuàng)作。然而，這個導數陳列顯著降低的熒光發(fā)射的天然蛋白和 photobleaches 相比速度非?？欤尸F比類似的單體綠色和黃色的熒光蛋白質更有用。廣泛誘變研究努力，包括新穎的技術，如迭代的體細胞變異，已成功地應用在尋求進一步減少這些潛在有效的生物探針的傾向自關聯(lián)，同時也把發(fā)射極大值對波長較長的黃色、 橙色、 紅色和遠紅光的熒光蛋白變體。結果一直改進單體的熒光蛋白的功能增加的消光系數、 量子產率和光穩(wěn)定性，雖然沒有單一的變異然而已被優(yōu)化，所有的標準。此外，預留 tetrameric 紅色熒光蛋白，可以通過努力來生成真正的單體變形，產生了衍生工具，克服表達問題是更符合生物學功能。

也許在這條戰(zhàn)線上的Zui壯觀的發(fā)展一直引進新的收獲來自單體紅色熒光蛋白 （mRFP1） 的熒光蛋白的通過定點突變靶向的q66 泰拳基本技法和Y67生色團殘留物，已證明發(fā)揮了關鍵作用，在確定在水母蛋白的光譜特征。由此產生的單體熒光蛋白干部表現出極大值在從 560 到 610 納米的波長和有在常見的水果，承擔類似于他們各自的熒光發(fā)射譜線輪廓的顏色的榮譽被命名。中"果"的潛在有效成員之間熒光蛋白系列，mStrawberry，?mCherry和tdTomato?(串聯(lián)二聚體），所有的一切都有熒光發(fā)射配置文件在橙色和紅色區(qū)域的光譜。這些探測器，tdTomato，在 581 納米有橘紅色排放量Zui大，是Zui聰明和Zui基質在視場照明下。然而，二聚體是兩次單體的分子量。紅色蛋白質、 mCherry 和 mStrawberry （排放的峰值 610 和 596 納米，分別），有大約 50%的亮度級別和 75%的綠色熒光蛋白，但 mCherry 是比 mStrawberry 更多基質，是Zui佳的探頭選擇，以取代 mRFP1 為長期成像實驗。這些新的蛋白質來填補Zui紅移的水母熒光蛋白質 （如金星) 和眾多的報道，市面上的寡聚珊瑚紅色熒光蛋白質之間的差距。雖然幾個這些新的熒光單體蛋白質缺乏的亮度和許多成像實驗必要的光穩(wěn)定性，他們的存在令人鼓舞的是因為它橫跨整個可見光譜表明明亮，穩(wěn)定，單體熒光蛋白的偶然性。

遠紅熒光蛋白

進一步延長水果蛋白質譜類通過迭代的超變已經產生了兩個新的熒光蛋白質與排放的 625 和 649 納米波長極大值，代表的第一次真正遠紅光 （從 630 到 700 納米） 轉基因探頭。Zui有可能有用的探測器在這雙被命名為mPlum，其中有一個相當有限的亮度值 （EGFP 的 10%），但優(yōu)良的光穩(wěn)定性。這個單體的探頭應與發(fā)光的青色、 綠色、 黃色和橙色區(qū)域為多色成像實驗 （見圖 11） 和作為一個生物傳感器綠色和黃色的蛋白質，例如 mEmerald （斯特距離，4.4） 和 mCitrine （斯特距離，5.0） 的伙伴 FRET 熒光蛋白在組合中有用。另一種遠紅熒光蛋白，稱為AQ143，得到了從誘變努力上分離的?？?strong>海葵馬種色素蛋白。AQ143 的激發(fā)和發(fā)射性能的極大值分別為 595 和 655 納米和亮度是 mPlum 相媲美。不利的方面，這種蛋白的光穩(wěn)定性研究尚未見報道，它形成預留四聚體。

多色成像跨越的青色通過遠紅光波長區(qū)域的三種熒光蛋白組合介紹了在圖 11 中的熒光篩選器進行了優(yōu)化。勵磁過濾器針對蔚藍、 人民圣戰(zhàn)者組織和 mPlum 熒光蛋白具有中心波長 425、 508，和 585 納米，分別進行優(yōu)化。勵磁的所有篩選器的帶寬是 20 納米。針對同一探頭分別有 480、 564，和 675 納米的中心波長與帶寬的 40、 28 和 130 納米，排放過濾器進行優(yōu)化。人民圣戰(zhàn)者組織激勵篩選器被為了工作繁忙，盡量減少同時激發(fā)的 mPlum。流血，通過的天藍色熒光發(fā)射入人民圣戰(zhàn)者組織篩選器減少的事實，人民圣戰(zhàn)者組織四次更亮等摩爾濃度和需要更短的曝光時間間隔的圖像捕獲。

結論

熒光蛋白發(fā)展主要推力為中心進行微調當前調色板的藍色到黃色熒光蛋白質來自水母維多利亞水母，同時發(fā)展單體熒光蛋白質發(fā)光的橙色到遠紅光區(qū)域的可見光的光譜。這些目標的進展已經取得了很大，它不是不可思議的近紅外發(fā)光的熒光蛋白織機在地平線上。在水母變形的Zui新努力造成新的和改進的單體探針為青色、 綠色和黃色區(qū)域，雖然為明亮、 單體，和快速成熟的紅色熒光蛋白的搜索已經產生了有希望的候選人延伸到更長的波長區(qū)域的主機。繼續(xù)的蛋白質工程的新技術，例如應用程序的非天然氨基酸和環(huán)狀排列，再加上現有的熒光蛋白應該進一步擴大顏色調色板。

復雜的相互作用的越來越多的來自海洋物種的種類繁多的熒光蛋白的生物學作用則剛剛開始被理解。光致變化到自催化的生色團，包括活化和實現，可以作為一個高度進化的光保護機制，協(xié)助這些有機體在有用耗散的高能陽光，尤其是破壞性的較短的波長，通過吸收和隨后熒光再發(fā)射的波長更長的時間和更安全。在許多情況下，這些顯著的熒光蛋白顯示很高的光穩(wěn)定性和動態(tài)光誘導轉化屬性，包括共振能量轉移的施主-受主對 （甚至葉柵） 光譜進行微調。大量的光譜變種已經發(fā)現，設有排放配置文件覆蓋整個可見光譜，表明這些蛋白質分子的各種光學和生化性質將生成新的候選主機作為探頭，用于生物調查并確保獨特轉基因熒光蛋白的持續(xù)的發(fā)展。