光程不相等問題分析

比耳定律假設(shè)所有入射光線通過相同數(shù)量的吸收粒子或假設(shè)所有入射光線通過吸光物質(zhì)的光程相等。其實(shí)不然，如果把一個(gè)樣品放在幾臺(tái)不同的紫外可見分光光度計(jì)上測(cè)試，盡管儀器都經(jīng)過認(rèn)真的調(diào)試、校驗(yàn)，但其測(cè)試結(jié)果是不會(huì)相同的。原因是多方面的，除前面所述因素的影響外，還有以下因素引起光程的變化，導(dǎo)致產(chǎn)生誤差。

①光束傾斜。

一般來(lái)講，從單色器出來(lái)的光照射到比色皿的時(shí)候，不可能是理想的平行光，總有一個(gè)孔徑角，因此，通過比色皿的平均光程總是大于垂直通過的光程長(zhǎng)度。研究表明，當(dāng)孔徑角小于5度時(shí)，吸光度A的誤差小于0.1%。

②比色皿引起的誤差。

大多數(shù)樣品是以溶液形式進(jìn)行分析測(cè)量的，因此，比色皿就成了重要部件。它的幾何尺寸的加工誤差、配對(duì)誤差會(huì)直接導(dǎo)致分析測(cè)試結(jié)果產(chǎn)生誤差。特別是比色皿的兩個(gè)通光面之間的距離和平行性，更是如此。英國(guó)標(biāo)準(zhǔn)研究所曾經(jīng)介紹過關(guān)于比色皿的技術(shù)要求。他們建議光程長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)精度必須達(dá)到±0．02mm，端面窗的平行性是每厘米4個(gè)光圈（用汞燈的546. 1nm測(cè)試），對(duì)于1Omm光程的比色皿，其標(biāo)定精度必須在±0．01mm內(nèi)。
根據(jù)我國(guó)國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程的要求，對(duì)我國(guó)某公司生產(chǎn)的比色皿進(jìn)行過測(cè)試。在三個(gè)月中（其中間隔一個(gè)月），先后從兩批產(chǎn)品中挑選62對(duì)比色皿進(jìn)行了配對(duì)檢測(cè)。第一批挑選32對(duì)比色皿，不合格者達(dá)22對(duì)，占68. 8%。第二批挑選30對(duì)比色皿，不合格者23對(duì)，占76. 6%。而該公司長(zhǎng)期從事比色皿的生產(chǎn)，用戶遍布全國(guó)各地，甚至大量出口國(guó)外。據(jù)該公司負(fù)責(zé)人講，從未聽到過使用者對(duì)他們生產(chǎn)的比色皿提出過配對(duì)不合格的意見。這說(shuō)明了廣大科技人員尚未對(duì)比色皿的配對(duì)誤差給紫外可見分光光度計(jì)的分析誤差帶來(lái)的嚴(yán)重影響引起重視。

③樣品處理和測(cè)量過程中產(chǎn)生的誤差。

不管測(cè)試什么樣品，總是要事先對(duì)樣品進(jìn)行處理。而對(duì)樣品進(jìn)行處理，總會(huì)因?yàn)閮x器設(shè)備等各種原因而帶來(lái)誤差。例如，稱量天平的誤差，取液的量筒或移液管等玻璃儀器的誤差，儀器條件選擇（如光譜帶寬、掃描速度等）、環(huán)境因素（如溫度、電磁場(chǎng)的干擾等）、人為操作誤差等。這些誤差都會(huì)引起比耳定律應(yīng)用的可靠性問題。
以上論述了光吸收的光學(xué)類分析儀器的理論基礎(chǔ)。即使是Zui簡(jiǎn)單的濾光片式的光吸收的光學(xué)分析儀器（如核酸蛋白分析儀器、酶標(biāo)儀、721等可見分光光度計(jì)等分子光譜分析儀器），也必須遵守這些理論。如果想設(shè)計(jì)制造出優(yōu)質(zhì)的光吸收類光譜儀器（高檔紫外可見分光光度計(jì)、高檔原子吸收分光光度計(jì)、高檔液相色譜光學(xué)類檢測(cè)器等），就必須掌握與這些儀器相關(guān)的儀器學(xué)理論。