顯微鏡,顯微鏡價(jià)格,顯微鏡的價(jià)格

　　流式檢測凋亡的討論

　　Update:2009-02-22From:ibioo.Com Hot:3684

　　　　關(guān)于凋亡的流式檢測

　　一、PI單染色法

　　基礎(chǔ)原理

　　其原理重要是根據(jù)細(xì)胞凋亡時(shí)在細(xì)胞、亞細(xì)胞和分子程度上所發(fā)生的特點(diǎn)性改變。這些改變包含細(xì)胞核的改變、細(xì)胞器的改變、細(xì)胞膜成分的改變和細(xì)胞形態(tài)的改變等，其中細(xì)胞核的改變Zui具特點(diǎn)性，主要包含以下幾個(gè)方面：

　　1.細(xì)胞核的改變：由于凋亡細(xì)胞核的改變，造成各種染色體熒光染料對(duì)凋亡細(xì)胞DNA可染性發(fā)生改變。研討表明，用各種染色體熒光染料對(duì)經(jīng)固定的凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色，其DNA可染性降低。很多學(xué)者把這種DNA可染性的降低認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的標(biāo)記之一。

　　2.光散射特性：凋亡細(xì)胞形態(tài)上的轉(zhuǎn)變影響它們的光散射特征。在流式細(xì)胞儀上，前散射光與細(xì)胞的大小有關(guān)，而側(cè)散射光反應(yīng)的是光在細(xì)胞內(nèi)的折射作用，與細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少有關(guān)。在細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞固縮，體積變小，故前散射光下降，這一特性往往被以為是凋亡細(xì)胞的特色之一。此外細(xì)胞凋亡時(shí)由于染色體降解，核決裂形成，細(xì)胞內(nèi)顆粒往往增多，故凋亡細(xì)胞側(cè)散射光常增添。細(xì)胞壞死時(shí)，由于細(xì)胞腫脹，其前散射光增大；側(cè)散射光在細(xì)胞壞死時(shí)也增大，因此可依據(jù)前散射光和側(cè)散射光差別凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。但需要注意的是，依據(jù)前散射光和側(cè)散射光斷定凋亡細(xì)胞的可靠性受被檢測細(xì)胞形態(tài)上的均一性和核胞漿比率影響很大。因此在某些淋巴細(xì)胞凋亡中，用光散射特性檢測凋亡的可靠性較好，而在腫瘤細(xì)胞凋亡中，其可靠性就較差。根據(jù)光散射特性檢測凋亡細(xì)胞Zui重要的長處是可以將光散射特征與細(xì)胞的表面免疫熒光剖析結(jié)合起來，用以差別經(jīng)這些特別處置產(chǎn)生選擇性凋亡的淋巴細(xì)胞亞型。也可用于活細(xì)胞的分類。

　　試劑與儀器

　　PBS溶液（配制方式見附錄）；

　　PI染液：將PI溶于PBS（pH7.4）中，終濃度為100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保留。

　　70%乙醇

　　400目篩網(wǎng)

　　流式細(xì)胞儀

　　實(shí)驗(yàn)步驟

　　1.收集細(xì)胞｛數(shù)目約（1~ 5）×106個(gè)/mL｝，500 ~ 1000 r/min離心5min，棄往培育液。

　　2.3ml　PBS洗滌1次。

　　3.離心去PBS，加進(jìn)冰預(yù)冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小時(shí)。

　　4.離心棄去固定液，3mlPBS重懸5min。

　　5.400目標(biāo)篩網(wǎng)過濾1次，500—1000r/min離心5min，棄往PBS。

　　6.用1ml　PI染液染色，4℃避光30min。

　　7.流式細(xì)胞儀檢測：PI用氬離子激發(fā)熒光，激光光波波長為488nm，發(fā)射光波波長大于630nm，發(fā)生紅色熒光分析PI熒光強(qiáng)度的直方圖也可分析前散射光對(duì)側(cè)散射光的散點(diǎn)圖。

　　8.成果斷定：在前散射光對(duì)側(cè)散射光的散點(diǎn)圖或地形圖上，凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，前散射光下降，而側(cè)散射光可高可低，與細(xì)胞的類型有關(guān)；在剖析PI熒光的直方圖時(shí)，先用門技巧消除成雙或湊集的細(xì)胞以及發(fā)微弱熒光的細(xì)胞碎片，在PI熒光的直方圖上，凋亡細(xì)胞在G1/G0期前呈現(xiàn)一亞二倍體峰。如以G1/G0期所在地位的熒光強(qiáng)度為1.0，則一個(gè)典范的凋亡細(xì)胞樣本其亞二倍體峰的熒光強(qiáng)度為0.45，可用雞和鮭魚的紅細(xì)胞的PI熒光強(qiáng)度做參照尺度，兩者分辨為0.35和0.7，可以確保在兩者之間的不是細(xì)胞碎片而是完全的細(xì)胞。

　　注意事項(xiàng)

　　細(xì)胞凋亡時(shí)，其DNA可染性降低被以為是凋亡細(xì)胞的標(biāo)記之一，但這種DNA可染性下降也可能是由于DNA含量的降低，或者是因?yàn)镈NA構(gòu)造的轉(zhuǎn)變使其與染料結(jié)合的才能產(chǎn)生改變所致。在分析結(jié)果時(shí)應(yīng)當(dāng)注意。

　　二、Heochst 33342/PI雙染色法

　　基礎(chǔ)原理經(jīng)固定的凋亡細(xì)胞其染色體熒光染料的DNA可染性性降落。細(xì)胞一經(jīng)固定就不再是活細(xì)胞，而且細(xì)胞固定進(jìn)程對(duì)細(xì)胞膜的通透性也有影響。因此發(fā)展了用“細(xì)胞活性”鑒定染料染色的流式細(xì)胞儀檢測方法。這些方法細(xì)胞不經(jīng)固定就直接用DNA染料染色，且染料的濃度要比固定細(xì)胞所用的濃度要低得多。流式細(xì)胞儀通常根據(jù)細(xì)胞膜完整性將細(xì)胞分為“活細(xì)胞”和“死細(xì)胞”，因此正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞回為活細(xì)胞?；罴?xì)胞染料如Hoechst 33342能少許進(jìn)入正常細(xì)胞膜而對(duì)細(xì)胞沒有太大得細(xì)胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度要比正常細(xì)胞中要高，Hoechst 33342在凋亡細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度增高的機(jī)制與凋亡細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變有關(guān)，凋亡細(xì)胞早期細(xì)胞膜的完整性沒有顯明性改變，但細(xì)胞膜的通透性已有加強(qiáng)，因此進(jìn)入凋亡細(xì)胞中的Hoechst 33342比正常細(xì)胞的多。此外，還與凋亡細(xì)胞的染色體DNA的構(gòu)造發(fā)生了改變從而使該染料能更有效地與DNA結(jié)合以及凋亡細(xì)胞膜上的p-糖蛋白泵功效受到損傷不能有效地將Hoechst 33342排出到細(xì)胞外使之在細(xì)胞內(nèi)積聚增添等有關(guān)。既然Hoechst 33342進(jìn)入凋亡細(xì)胞中比正常細(xì)胞更輕易，而EB、PI或7-AAD等染料是不能進(jìn)入細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞中，即正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞在不經(jīng)固定的情形下對(duì)這些染料是拒染，壞死細(xì)胞由于膜完整性在早期即已破損，可被這些染料染色。根據(jù)這些特性，用Hoechst 33342結(jié)合PI或EB等染料對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行雙染色，就可在流式細(xì)胞儀上將正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)別開來。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，這三群細(xì)胞表示分辨為：正常細(xì)胞為低藍(lán)色/低紅色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡細(xì)胞為高藍(lán)色/低紅色（Hoechst 33342++/PI+），壞死細(xì)胞為低藍(lán)色/高紅色（Hoechst 33342+/PI++）。

　　試劑與儀器

　　lHeochst 33342 染液：用PBS配成10ug/ml的儲(chǔ)存液濃度，4℃避光保留；

　　PI染液 ：用PBS配成5ug/ml濃度，4℃避光保存。

　　400目標(biāo)篩網(wǎng)

　　流式細(xì)胞儀

　　試驗(yàn)步驟

　　1.懸浮生長的細(xì)胞在培養(yǎng)的狀態(tài)下加入Heochst 33342 ，終濃度為1ug/ml； 37℃孵育7—10min。

　　2.低溫500 ~ 1000r/min離心5min棄去染液。

　　3.參加1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。

　　4.400目標(biāo)篩網(wǎng)過濾1次。

　　5.流式細(xì)胞儀分析：Heochst 33342用氪激光激發(fā)的紫外線熒光，激發(fā)光波波長為352nm，發(fā)射光波波長為400 ~ 500nm，產(chǎn)生蘭色熒光；PI用氬離子激光激發(fā)熒光，激發(fā)光波波長為488nm，發(fā)射光波波長大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光。分析蘭色熒光對(duì)紅色熒光的散點(diǎn)圖或地形圖。

　　6.結(jié)果判定：在蘭色熒光對(duì)紅色熒光的散點(diǎn)圖上，結(jié)果為：正常細(xì)胞為低藍(lán)光/低紅光，凋亡細(xì)胞為高藍(lán)光/低紅光，壞死細(xì)胞為低藍(lán)光/高紅光。

　　注意事項(xiàng)

　　1.在紅色熒光對(duì)蘭色熒光散點(diǎn)圖上，還可見到細(xì)胞凋亡區(qū)向細(xì)胞壞死區(qū)遷移的軌跡，可能是凋亡細(xì)胞的DNA進(jìn)一步降解的緣故。

　　2.用Heochst 33342染料與細(xì)胞孵育的時(shí)間不宜過長，一般把持在20min之內(nèi)為宜。如果太長可引起Heochst 33342的發(fā)射光譜由藍(lán)光向紅光的遷移，導(dǎo)致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變，從而影響結(jié)果的判定。

　　三、Annexin V/PI雙染色法

　　基礎(chǔ)原理

　　細(xì)胞凋亡早期轉(zhuǎn)變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，目前早期辨認(rèn)仍有艱苦。這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。PS是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常重要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂散布的不對(duì)稱性被損壞而使PS裸露在細(xì)胞膜外。Annexin V是一種Ca+依附的磷脂結(jié)合蛋白，Zui初發(fā)明是一種具有很強(qiáng)的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特征。對(duì)PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充任一敏感的探針檢測暴露在細(xì)胞膜表面的PS。PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所奇特的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方法間的差異是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就損壞了。因此，可以樹立一種用Annexin V結(jié)合在細(xì)胞膜表面作為凋亡的唆使并結(jié)合一種染料消除實(shí)驗(yàn)以檢測細(xì)胞膜的完全性的檢測方法。

　　試劑與儀器

　　孵育緩沖液：10mmol/L HEPES/NaOH，PH 7.4，140mmol/L NaCl，5mmol/L CaCl2

　　標(biāo)記液：將FITC- Annexin V（寶靈曼公司產(chǎn)品）和PI加進(jìn)到孵育緩沖液中，終濃度均為1ug/ml

　　流式細(xì)胞儀

　　實(shí)驗(yàn)步驟

　　1.細(xì)胞收集：懸浮細(xì)胞直接受集到10ml的離心管中，每樣本細(xì)胞數(shù)為（1~5）×106，/mL　500~1000r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液。

　　2.用孵育緩沖液洗滌1次，500~1000r/min離心5min。

　　3.用100ul的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10~15min。

　　4.500~1000r/min離心5min沉淀細(xì)胞孵育緩沖液洗1次。

　　5.參加熒光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20min，避光并不時(shí)振動(dòng)。

　　6.流式細(xì)胞儀分析：流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長用488nm，用一波長為515nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于560nm的濾器檢測PI。

　　7.成果斷定：凋亡細(xì)胞對(duì)所有用于細(xì)胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞逝世細(xì)胞則不能。細(xì)胞膜有損傷的細(xì)胞的DNA可被PI著染發(fā)生紅色熒光，而細(xì)胞膜堅(jiān)持完好的細(xì)胞則不會(huì)有紅色熒光發(fā)生。因此，在細(xì)胞凋亡的早期PI不會(huì)著染而沒有紅色熒光信號(hào)。正?；罴?xì)胞與此類似。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細(xì)胞，即壞逝世細(xì)胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為凋亡細(xì)胞，浮現(xiàn)（FITC+/PI-）。

　　可能存在一下幾種原因:

　　1、首先是細(xì)胞方面:

　　(1)細(xì)胞狀況不好(朽邁)

　　(2)流式細(xì)胞儀前細(xì)胞處置時(shí)間過長,如消化后細(xì)胞放置時(shí)光長,固定不好.

　　(3)離心過度等

　　2、檢測試劑問題:過期等.試劑染色時(shí)光過長等.

　　3、流式細(xì)胞儀:

　　(1)參數(shù)設(shè)置不是優(yōu)化的,可以用正凡人血檢測機(jī)器.

　　(2)假如是Annexin V/PI雙染色法,存在Zui后結(jié)果劃線不準(zhǔn)問題.

　　(3)如果PI單染色法,存在沒有找到準(zhǔn)確的凋亡峰等.

　　PI染色后，流式細(xì)胞儀檢測調(diào)亡的原理

　　hanglh：PI染色后，用流式細(xì)胞儀檢測調(diào)亡的原理，及該看點(diǎn)哪些參考書籍和文獻(xiàn)。

　　大通達(dá)：實(shí)際上用PI染色基本分不出凋亡還是非凋亡性死亡，只是都按凋亡算了而已，因此用PI染色所得的凋亡率要大于實(shí)際凋亡率。

　　zbbnet：細(xì)胞固定后用PI染色，因?yàn)镻I特異性結(jié)合于細(xì)胞DNA，熒光強(qiáng)度與PI的結(jié)合量呈良好的線性關(guān)系。由于凋亡細(xì)胞核酸內(nèi)切酶活化，DNA降解，細(xì)胞DNA減少，因而可在G0/G1峰前呈現(xiàn)一個(gè)亞二倍體峰，也就是凋亡峰。

　　lard：除左跑gel 之外Zui平就是他了. (PI 一?flow sample 才RMB 0.6, 不?機(jī)的?)。其?跑gel+PI 已??明那?西是?引起apoptosis。用antibody/kit 都是另有請(qǐng)求.

　　shaman3：實(shí)在，PI分不清晚期凋亡和已經(jīng)死的細(xì)胞，在做有關(guān)凋亡的流式檢測的時(shí)候應(yīng)用的是磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）

　　磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，裸露在細(xì)胞外環(huán)境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依附性磷脂聯(lián)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)志了的Annexin-V作為熒光探針，應(yīng)用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生?！　?

　　碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完全的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和逝世細(xì)胞，PI能夠透細(xì)致胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配應(yīng)用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)離開來。

　　lard：PI 是?接了?, 但PI + 跑gel 是?有方法中的方法。去ncbi 找一找, 很多paper 也是用PI + 跑gel ?了.

　　DONGHAIJU：參考軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社出版的細(xì)胞凋亡的分子醫(yī)學(xué)，胡野，凌志強(qiáng)，單小云主編

　　腸組織勻漿流式細(xì)胞檢測凋亡的方式

　　coldant: 請(qǐng)問：腸組織勻漿流式細(xì)胞檢測凋亡的方法

　　schoman: 組織檢測凋亡還是很難的。勻漿后大部分細(xì)胞輕易受損壞，利用于流式檢測不適合。

　　關(guān)于Annexin V-FITC和PI雙染流式檢測方法

　　fjmusy: 我要應(yīng)用Annexin V-FITC和PI雙染的流式檢測，須要送到我們醫(yī)院的流式試驗(yàn)室往由他們做?？墒撬麄儧]有做過Annexin V-FITC的，只做過PI單染的。

　　1、不知道這樣雙染和只有PI 的有什么差異嗎？

　　2、在送檢時(shí)對(duì)標(biāo)本的量請(qǐng)求多少？

　　3、成果如何分析？是否要做二倍體（這是什么？闡明什么？）剖析？

　　zhaoqingshan: 以前我做過一些，大致如下：細(xì)胞要活的，不能固定，你可以用寶賽的試劑盒(電話是是82020225，我恰好也盤算做了，身邊就放了一張名片)，里面有具體的闡明。有些記不情了，細(xì)胞是消化下來后，直接加上兩種熒光染料，孵育，離心洗去過剩的染料，然后上機(jī)檢測，因?yàn)槭腔畹募?xì)胞，盡量做到隨做隨測。結(jié)果盤算凋亡細(xì)胞、死細(xì)胞、活細(xì)胞的比例或者個(gè)數(shù)就可以了。它分為四個(gè)象限，每個(gè)象限代表的不一樣

　　conanthird: 下面是兩種染色的原理：磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）

　　磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，裸露在細(xì)胞外環(huán)境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依附性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，應(yīng)用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

　　碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透細(xì)致胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)離開來。

　　方法

　　1、懸浮細(xì)胞的染色：將正常造就和引誘凋亡的懸浮細(xì)胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC標(biāo)記的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室溫避光30min，再加進(jìn)PI（50ug/ml）5ul，避光反映5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測（一般不超過1h）， 同時(shí)以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對(duì)比。

　　2、貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗滌、染色和分析同懸浮細(xì)胞。

　　3、爬片細(xì)胞染色：同上，Zui后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行察看。

　　注意事項(xiàng)

　　1、全部操作動(dòng)作要盡量柔柔，勿用力奏樂細(xì)胞。

　　2、操作時(shí)注意避光，反映完畢后盡快在一小時(shí)內(nèi)檢測。

　　drake015: 晶美代理benderAnnexin V-FITC試劑盒

　　目 錄 號(hào)： LHK601-100

　　儲(chǔ)存溫度： 2-8℃

　　規(guī) 格： 100 Tests

　　有 效 期： 見外包裝盒

　　試劑盒組份

　　1、結(jié)合緩沖液 4x (Binding Buffer 4x)：體積：20ml（4倍濃縮液）；

　　稀釋后溶液中各組分濃度：10mM Hepes/NaOH, pH 7.4, 140mM NaCl, 2.5mM CaCl2

　　2、碘化丙錠溶液 （Propidium Iodide）體積： 1.0ml；濃度：20ug/ml

　　3、重組人Annexin V/FITC, (rh Annexin V/FITC)

　　來 源：大腸桿菌（E.coli）

　　分 子 量：35.8 KDa

　　樣 品 量：0.5ml，可用于100次實(shí)驗(yàn)

　　保存方式：于50mM TRIS, 100mM NaCl, 1%BSA, 0.02%NaN3,pH7.4 溶液中保留

　　純 度：SDS-PAGE及反相HPLC表明純度大于98%

　　生物活性：Annexin V可結(jié)合于磷酯酰絲氨酸并表示出抗磷酯酶活性

　　應(yīng) 用：

　　標(biāo)志的Annexin V可結(jié)合流式細(xì)胞儀用于檢測細(xì)胞外膜上的磷酯酰絲氨酸，操作流程如下：

　　1、用去離子水按1:4稀釋結(jié)合緩沖液（20ml結(jié)合緩沖液+60ml去離子水）；

　　2、PBS充足洗細(xì)胞，取總數(shù)約為5-12.5×104的細(xì)胞待測；

　　3、用250ul結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞并使其濃度為2-5×105/ml；

　　4、取195ul的細(xì)胞懸液參加5ul Annexin V/FITC;

　　、混勻后于室溫避光孵育10分鐘；

　　6、用190ul的結(jié)合緩沖液洗細(xì)胞一次；

　　7、用190ul的聯(lián)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞；

　　8、加入10ul 20ug/ml的碘化丙錠溶液（終濃度為：1ug/ml）;

　　9、流式細(xì)胞儀（FACS）分析.

　　實(shí)際利用時(shí)和使用單位的具體用法有關(guān)，Zui好先去和醫(yī)院fcm操作者接洽一下，核實(shí)細(xì)胞數(shù)、加染色劑的時(shí)光以及其他特別要求。

　　操作者一般都會(huì)給出分析結(jié)果。具體也可以和操作者接洽，可以具體訊問，這里不羅嗦。

　　我用的就是晶美的產(chǎn)品，就我個(gè)人的操作這方面已請(qǐng)教了很多人。僅看產(chǎn)品闡明書上的操作步驟還是不行的，不夠細(xì)。比如Zui根本的是在冰浴中操作就沒有提到。但是現(xiàn)在我的麻煩在于流式細(xì)胞儀的操作者不知道雙染和PI單染的操作有什么差異，所以不愿意給我作

　　cyc1sbs5: 單染和雙染在應(yīng)用流式細(xì)胞儀時(shí)的差別在于雙染時(shí)需調(diào)劑兩種染料間的補(bǔ)償,不過著須要必定的經(jīng)驗(yàn),你Zui好還是找有經(jīng)驗(yàn)的人做吧

　　dhplc: the difference between single staining and dual stain in annexin v analysis lies on the precision of the results you obtained and,as mentioned above,you must do a complex compensation in dual staining.but any experienced flow cytometry staff has no problem in doing so.

　　as to your issue,i think it's not you but the flow cytomerty staff to think of this tenichological stuff.if he have not such know-how of setting flow cytometer's compensation and still have interests i'd like to give some start informations.

　　fjmusy: 我請(qǐng)教了優(yōu)美的技巧職員,確切就如cyc1sbs5說的那樣,須要調(diào)補(bǔ)償,也就是圖象所在象限的調(diào)節(jié)吧.

　　killwhale：我籌備將載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞后檢測細(xì)胞的凋亡情形，看了壇子里的先容，方法有很多，我想用流式雙染和DNAladder兩種方法來測。但是流式檢測的細(xì)胞數(shù)較高，一般細(xì)胞轉(zhuǎn)染用x10的4次方的細(xì)胞就夠了，但流式檢測需要的細(xì)胞量遠(yuǎn)大于10的4次方。請(qǐng)問：

　　1、流式檢測（Annexin V和PI雙染）需要的細(xì)胞數(shù)Zui低多少？

　　2、載體轉(zhuǎn)染后，應(yīng)該多久測細(xì)胞的凋亡比擬好？

　　iceblue909:流式檢測（Annexin V和PI雙染）需要的細(xì)胞數(shù)Zui低大概要1×105，Zui好1×106，一個(gè)六孔板差未幾就夠了。

　　長江: 流式檢測（Annexin V和PI雙染）的辦法：

　　1.收集細(xì)胞，至少要1.0×105，PBS或Binding buffer洗滌。

　　2.用Binding buffer重新懸浮細(xì)胞，需要的量為1.0×105/100ul。

　　3.加Annexin V和PI，室溫避光孵育15分鐘，并動(dòng)搖。

　　4.一小時(shí)內(nèi)檢測。

　　至于載體轉(zhuǎn)染后，應(yīng)當(dāng)多久測細(xì)胞的凋亡，應(yīng)依據(jù)你實(shí)驗(yàn)所采取的引誘細(xì)胞凋亡的試劑或藥物而定。

　　wkai: 請(qǐng)問采取AnnexinV與PI雙染色（流式細(xì)胞儀）檢測凋亡，操作是否艱苦？標(biāo)本若是組織，如何處置？有特別請(qǐng)求嗎？另外，AnnexinV與PI是否需離開購置？有相干試劑盒嗎？經(jīng)費(fèi)需要多少？

　　biowind: 流式細(xì)胞儀能測組織嗎？思考中........

　　gogowl：不艱苦，有試劑盒賣。成套試劑盒20次的大概1400元左右，單獨(dú)買很難搞到Annexin V biding buffer。

　　midas: 組織進(jìn)行流式細(xì)胞似乎沒有聽說過，但是體內(nèi)組織進(jìn)行凋亡檢測處所法也很多：如tunnel法，DNA ladder，caspase活性檢測等等。

　　wkai: 我在文獻(xiàn)上看到有研討將組織分別為細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，只是沒有具體方法，不知是否好做。

　　fjmusy: 我要用流式檢測貼壁的甲狀腺細(xì)胞凋亡情形，使用光鏡，和PI、Annexin V雙染色流式細(xì)胞儀檢測。敏銳度？可信度？價(jià)錢？操作煩瑣嗎？總之，對(duì)碩士研討生來說，這種辦法好嗎？還是有更好的方法？

　　qingshi: Annexin VZui可行,利用Annexin V-FITC/PI雙染色法是目前檢測凋亡的Zui敏感的方法之一，能檢測出早期凋亡細(xì)胞，并區(qū)分出壞死細(xì)胞.

　　美國有名生物試劑公司CLONTECH和INTERGEN公司分辨開發(fā)了多種標(biāo)記的Annexin V產(chǎn)品，簡便快速，10分鐘就可完成檢測。其中帶熒光標(biāo)志的Annexin V-EGFP（Enhanced Green Fluorescent Protein）及Annexin V-FITC，敏銳度高，可作為FACS（流式細(xì)胞分選）方法篩選凋亡細(xì)胞的基本。由于融會(huì)蛋白Annexin V-EGFP，EGFP與PS 的聯(lián)合比例為1：1，還可進(jìn)行定量檢測。除此之外，還供給生物素偶聯(lián)的Annexin V，可通過常用的酶聯(lián)顯色反映來檢測。另外，MACS公司將磁珠包被Annexin V，可采取磁分選辦法篩選凋亡細(xì)胞。

　　由于PI法實(shí)用于死細(xì)胞(固定細(xì)胞)的細(xì)胞周期檢測較好,對(duì)于凋亡,只能看出后凋亡,前凋亡無法看出.而Annexin V是直接對(duì)活細(xì)胞檢測,前后凋亡都可檢出.

　　handshealing: 實(shí)在我感到用PI單染就可以了，老外作流式也是用PI單染的，操作也挺便利的！假如經(jīng)費(fèi)有限不妨斟酌！

　　ANNEXINFITC: 不是說Annexin V-FITC是檢測凋亡的金尺度嗎？我干了一年多了還是零。有哪位做過流式Annexin V-FITC檢測凋亡的高手能給指導(dǎo)一下迷津？我底本是要做去甲腎上腺素引誘凋亡的，用Annexin V-FITC來檢測，可是不論用到多大批的去甲，心肌細(xì)胞看起來還是活蹦亂跳的，Annexin V-FITC也做不出結(jié)果。這是國外文獻(xiàn)有做不少的，然而我做不出來。

　　我是這么做的：原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞（約500000個(gè)細(xì)胞/孔，12孔板）狀況良好后低血清（1％FBS）培養(yǎng)24h,加入去甲腎上腺素，再造就24h，然后按解釋書操作在流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率?？慈思覍懙暮芎喡裕墒前讶ゼ椎臐舛榷技佣?00倍了，也得不到陽性結(jié)果！我不知道到底哪里錯(cuò)了，是Zui后Annexin V-FITC的操作有錯(cuò)？還是去甲用的不對(duì)？還是加的方法不對(duì)？總不會(huì)是它原來就沒這作用，人家老外都撒謊吧??？

　　hdhdhd0000: 我沒做過，但，問：1、老外是不是用的心肌細(xì)胞？2、去甲是否失效？3、做Annexin V-FITC時(shí)的操作是否有效？

　　ymzhao: 我沒做過Annexin V-FITC染色的凋亡測定， 但是我在用神經(jīng)細(xì)胞造凋亡模型時(shí)有這樣的領(lǐng)會(huì)， 假如雜質(zhì)細(xì)胞比例大， 則很難造出損傷， 而且細(xì)胞狀況要好， 才行。實(shí)在不行， 先用Hoechst染色察看一下是否有凋亡。

　　wangzhang: 我固然沒有做過Annexin V-FITC的凋亡檢測,但做過其他方法的凋亡檢測,感到需要注意的是一樣的,所以我以為你可以從以下幾點(diǎn)斟酌:

　　1、去甲是否對(duì)心肌細(xì)胞有用

　　2、做凋亡檢測時(shí),細(xì)胞應(yīng)該用5%-10%的FBS,而不是1%的FBS,因?yàn)樵诘蜐舛鹊难逑?就算什么藥都不加,細(xì)胞也長不好,這樣陰性對(duì)比就做不出來了.

　　3、收集細(xì)胞時(shí),應(yīng)當(dāng)將培育上清也收集,由于有凋亡的細(xì)胞漂起來了.

　　4、去甲Zui好買入口的

　　5、你提到"心肌細(xì)胞看起來還是活蹦亂跳的",我不太清楚,因?yàn)榈脱逑?原代培養(yǎng)的細(xì)胞48小時(shí)也能活蹦亂跳的,有點(diǎn)不可思意,你的細(xì)胞沒有問題嗎?

　　xindu0524: 你的陽性對(duì)比如何？這點(diǎn)很要害。

　　ANNEXINFITC: 我現(xiàn)在還是沒找到原因，還好廠家沒太說什么，叫改別的做了。不過，原代培育的乳鼠心肌細(xì)胞是會(huì)搏動(dòng)的，造就的好的話可以很明白的看見搏動(dòng)一波一波地從細(xì)胞一端傳向另一端并傳到相鄰細(xì)胞，很好玩。唉，就是做不出試驗(yàn)。

　　echo9450627: 我個(gè)人認(rèn)為凋亡的金尺度的電鏡檢測的照片！

　　


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