檸檬酸鈉對L-組氨酸發(fā)酵代謝流散布的影響Effects of Sodium Citrate on Metabolic Flux Distributions of L-Histidine Production目標(biāo):樹立谷氨酸棒桿菌TL1105生物合成L-組氨酸的代謝網(wǎng)絡(luò)模型,并進(jìn)行代謝網(wǎng)絡(luò)計(jì)量剖析.方式:通過所構(gòu)建的L-組氨酸代謝網(wǎng)絡(luò)模型,應(yīng)用MATLAB軟件盤算出添加檸檬酸鈉和不添加檸檬酸鈉發(fā)酵中后期代謝網(wǎng)絡(luò)的代謝流散布.成果:在L-組氨酸分批發(fā)酵進(jìn)程中,在發(fā)酵初期未添加檸檬酸鈉的條件下賤向戊糖磷酸道路(HMP)的代謝流為9.59,合成組氨酸的代謝流為8.91;在發(fā)酵初期添加2 g/L檸檬酸鈉的條件下賤向HMP的代謝流為12.74,合成組氨酸的代謝流為9.61.結(jié)論:在發(fā)酵初期添加檸檬酸鈉能夠轉(zhuǎn)變L-組氨酸生物合成門路的要害節(jié)點(diǎn)6-磷酸葡萄糖、丙酮酸及乙酰輔酶A的代謝流散布,堅(jiān)持糖酵解門路、三羧酸循環(huán)與HMP之間代謝流量平衡,有利于進(jìn)步L-組氨酸生物合成道路的代謝流量,終極使流向組氨酸的代謝流增添了7.86%.
從系統(tǒng)生物學(xué)到體系發(fā)酵http://www.sciencenet.cn/m/user_content.aspx?id=331803
張星元的博客 生不帶來逝世不帶往，隨緣接好智慧和文化的接力棒，認(rèn)真?zhèn)鬟f下往
通過發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)的幾十年實(shí)踐（以抗生素和氨基酸為代表），人們逐步認(rèn)識到發(fā)酵工業(yè)進(jìn)程是一個(gè)隨著時(shí)光變更的（時(shí)變的）、非線性的、多變量輸進(jìn)和輸出的動態(tài)過程，依照化學(xué)工程的模式來處置發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)（特殊是大范圍生產(chǎn)）的問題，往往難以收到預(yù)期的后果。從化學(xué)工程的角度來看，發(fā)酵罐也就是生產(chǎn)原料的反映器，發(fā)酵罐中培養(yǎng)的微生物細(xì)胞只是一種“催化劑”，按化學(xué)工程的正統(tǒng)思維往尋找工業(yè)發(fā)酵的規(guī)律，半個(gè)多世紀(jì)幾乎是勞而無功，有人把發(fā)酵視為藝術(shù)而自我撫慰；多數(shù)發(fā)酵科技職員不情愿望而生畏，不忍心埋沒微生物的生產(chǎn)潛力，測量顯微鏡價(jià)格，于是，從原始的手工作坊式的發(fā)酵生產(chǎn)技巧的生物學(xué)內(nèi)核動身，向生物學(xué)靠攏，在實(shí)踐中對發(fā)酵工程的屬性有了新的認(rèn)識。發(fā)酵工程的生物學(xué)屬性的認(rèn)定，讓發(fā)酵生產(chǎn)的主體徹底地回回微生物，發(fā)酵工程的發(fā)展有了明白的方向，發(fā)酵工程進(jìn)進(jìn)了生物工程的范圍。顯然，現(xiàn)代發(fā)酵工程將成為一門由多學(xué)科交叉、融會而形成的技術(shù)性和利用性較強(qiáng)的開放性的學(xué)科。
可是遺憾的是，只要稍加留意，不難發(fā)明當(dāng)今發(fā)酵工程的科技書籍和教材，往往沿用以往的“菌種?發(fā)酵?提煉（下游技巧）”的體例，這種從工藝操作規(guī)程衍生出來的體例難于表述發(fā)酵產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)的生物學(xué)屬性，難以將菌種（遺傳）和培育工藝（條件）作為一個(gè)整體（龐雜系統(tǒng)）來深刻討論，難以進(jìn)步對菌種選育和工藝把持的準(zhǔn)確性，還輕易助長把生物工程等同于化學(xué)工程而疏忽其生物學(xué)屬性的偏向、不利于微生物造就（發(fā)酵進(jìn)程）主動節(jié)制過程。
因此發(fā)酵工程隊(duì)伍必需觀念更新，從生物學(xué)和生物工程的角度重新認(rèn)識發(fā)酵工程和發(fā)酵產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)的靈魂??微生物細(xì)胞耗散構(gòu)造，以及以微生物細(xì)胞為行動主體的工業(yè)發(fā)酵龐雜系統(tǒng)。在這個(gè)復(fù)雜體系中，其主體微生物細(xì)胞是有效的化學(xué)反映系統(tǒng)和自我復(fù)制的系統(tǒng)：微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其高度有序的性命狀況要靠耗費(fèi)可被其自身直接應(yīng)用的能量??代謝能來保持；要做到這一點(diǎn)，微生物活細(xì)胞必需是能進(jìn)行能量情勢轉(zhuǎn)換的有效的化學(xué)反響系統(tǒng)；細(xì)胞靠其自身的結(jié)構(gòu)來行使能量情勢轉(zhuǎn)換及能量支持的功效，而用來再造自身的生物學(xué)信息則存在于細(xì)胞構(gòu)造之中，因此活細(xì)胞又是自我復(fù)制的系統(tǒng)。
系統(tǒng)生物學(xué)的整體性研究的方略的實(shí)行對象就是生物復(fù)雜系統(tǒng)，應(yīng)該也實(shí)用于微生物龐雜系統(tǒng)。以發(fā)酵學(xué)三假說為核心的工業(yè)發(fā)酵生物學(xué)理論框架已經(jīng)樹立，微生物細(xì)胞復(fù)雜系統(tǒng)的能量、物資、信息的關(guān)系已經(jīng)初步理順，假如試驗(yàn)室和中間實(shí)驗(yàn)條件允許（組學(xué)測試和代謝工程實(shí)驗(yàn)研究的條件），就可以對產(chǎn)業(yè)發(fā)酵的微生物復(fù)雜系統(tǒng)實(shí)行系統(tǒng)生物學(xué)的整體性研討方略，發(fā)酵工程的列車就可以比擬順利地進(jìn)進(jìn)系統(tǒng)發(fā)酵學(xué)的軌道。這樣，發(fā)酵生產(chǎn)的第二次奔騰??發(fā)酵生產(chǎn)的生物工程光輝成功就不遠(yuǎn)了
基于構(gòu)造信息的蛋白質(zhì)相互作用規(guī)律的研討
微生物降解芳烴化合物過程中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功效研究在過去的幾十年，有關(guān)各種芬芳化合物的微生物代謝途徑的研究在生化水溫和分子程度都進(jìn)行了具體的研究(http://umbbd.ahc.umn.edu)。相比擬微生物代謝途徑的大批研究，有關(guān)芳香化合物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究的報(bào)道卻少的多。 Ralstonia sp， strain U2通過龍膽酸代謝門路降解萘，但是卻不能利用龍膽酸作為唯一的碳源和能源生長。本研究將來自谷氨酸棒桿菌ATCC13032的ncgl2922基因編碼的可能的龍膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在Ralstonia sp. strain U2中異源表達(dá)，使得U2菌能夠利用龍膽酸作為碳源和能源進(jìn)行生長。利用質(zhì)粒pGFPe，ncgl2922基因與質(zhì)粒本身帶有的綠色熒光蛋白基因在大腸桿菌細(xì)胞中融會表達(dá)。共聚焦顯微鏡察看結(jié)果表明，融合蛋白只位于大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)膜上，而只帶有質(zhì)粒pGFPe的大腸桿菌細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白廣泛的分布于全部細(xì)胞質(zhì)中。酶活測定結(jié)果表明，U2野生型菌株在龍膽酸誘導(dǎo)下，龍膽酸1，2-雙加氧酶的酶活力僅處于一個(gè)極低的程度，僅僅是自然誘導(dǎo)物水楊酸誘導(dǎo)活力的五分之一，而帶有轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GenK(Ncg12922)的Ralstonia sp. strain U2工程菌在水楊酸和龍膽酸分別引誘時(shí)龍膽酸1，2-雙加氧酶的酶活力均與Ralstonia sp. strain U2野生菌在自然引誘物水楊酸誘導(dǎo)時(shí)酶活力水平相當(dāng)。闡明恰正是由于龍膽酸無法進(jìn)入細(xì)胞而使得Ralstonia sp. strain U2菌固然存在龍膽酸代謝途徑，但是不能直接利用龍膽酸進(jìn)行生長。并通過趨化試驗(yàn)證實(shí)了，GenK(Ncg12922)僅行使龍膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，而非兼有趨化蛋白的功效。 Klebsiella pneumoniae M5a1通過龍膽酸代謝道路降解3-羥基苯甲酸(3-hydroxybenzoate)，在Klebsiella pneumoniae M5a1全部3-羥基苯甲酸代謝基因簇的在Pseudomonas putida PaW340中異源表達(dá)之后，通過對該基因簇的mhbT基因敲除和互補(bǔ)，以3-羥基苯甲酸和龍膽酸為底物分離進(jìn)行生長試驗(yàn)和HPLC檢測，證實(shí)了MhbT是3一羥基苯甲酸/龍膽酸雙功能的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其在3-羥基苯甲酸代謝的龍膽酸途徑中起著癥結(jié)的作用。第二，MhbT-GFP融會蛋白同源(Klebsiella pneumoniae M5a1野生型)和異源(P. putida PaW340和E coli BL21(DE3))兩種方法表達(dá)后，通過共聚焦顯微鏡視察，均定位在細(xì)胞膜上。第三，在野生型Klebsiella pneumoniae M5a1中過量表達(dá)MhbT，經(jīng)過酶學(xué)分析檢測，數(shù)據(jù)顯示：經(jīng)過3-羥基苯甲酸引誘3-羥基苯甲酸6-單加氧酶和龍膽酸1，2-雙加氧酶的活力分別提高大約2.5倍和3倍；而龍膽酸誘導(dǎo)后的活氣幾乎未變，闡明了MhbT在3-羥基苯甲酸代謝的主要性。第四，MhbT作為革蘭氏陰性菌的龍膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在革蘭氏陽性菌Corynebacterium glutamicum中能準(zhǔn)確地表達(dá)和行使功能。 綜上所述，本項(xiàng)研究利用分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等技術(shù)，通過高效液相色譜分析，紫外分光光度計(jì)和紫外共聚焦顯微術(shù)等多種手腕對龍膽酸和3-羥基苯甲酸/龍膽酸兩種新型的芬芳酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行體內(nèi)和體外的表達(dá)，鑒定兩種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能及其對后續(xù)酶活力的影響，并斷定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在細(xì)胞中表達(dá)的地位。揭示降解龍膽酸和3-羥基苯甲酸代謝的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，從而說明谷氨酸棒桿菌作為革蘭氏陽性菌模式菌和肺炎克氏桿菌作為革蘭氏陰性菌模式菌在細(xì)胞程度對芬芳酸化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。同時(shí)分析轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對后續(xù)酶活力的影響，同時(shí)在另一個(gè)角度可以解釋轉(zhuǎn)遠(yuǎn)蛋白與代謝相干。要害詞：Corynebacterium glutamicum ATCC 13032，Klebsiella pneumoniae M5a1，Pseudomonas putida PaW340； Ralstonia sp. strain U2，3-羥基苯甲酸，龍膽酸，3-羥基苯甲酸6-單加氧酶，龍膽酸1，2.雙加氧酶，龍膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，3-羥基苯甲酸/龍膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，共聚焦顯微鏡，異源表達(dá)。
清華大學(xué)生物信息與體系生物學(xué)研究所,教導(dǎo)部生物信息學(xué)重點(diǎn)試驗(yàn)室,生物膜和膜生物技巧國度重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京,產(chǎn)纖維素酶微生物的分別、誘變育種及混菌發(fā)酵纖維素的研討燃料乙醇是一種可替換化石能源的主要燃料。它具有便宜、干凈、環(huán)保、安全、可再生等長處,對解決未來能源問題有著宏大的潛力和遼闊的利用遠(yuǎn)景。因此,研究以便宜的農(nóng)作物秸稈等富含纖維素的生物廢物為原料生產(chǎn)燃料乙醇具有主要的意義。本文研究了從南京紅山動物園食草動物的糞便及土樣中分別出的14種產(chǎn)纖維素酶菌株的相干特點(diǎn),以一號,二號菌株為出發(fā)菌株,經(jīng)紫外線誘變獲得了幾株高產(chǎn)纖維索酶的突變株。以稻草,毛豆殼,玉米棒為原料,利用誘變精良菌株和酵母菌分辨混菌發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇。 (1)從南京紅山動物園食草動物的糞便及土樣中分別出14種產(chǎn)纖維素酶菌株,分離從形態(tài),芽孢染色,鞭毛染色,革蘭氏染色,生長曲線等方面進(jìn)行辨別,對一號菌株還進(jìn)行了糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn),吲哚,甲基紅,V.P試驗(yàn),以及16S rDNA序列同源性剖析。成果表明：8和13號菌株為霉菌,其余均是細(xì)菌。3,5,9,ll,14號菌株有芽孢,其余菌均未能看到芽孢,所有細(xì)菌都有鞭毛。除了8和13號菌種外,大部分都是桿狀菌,其中1,2,4,5,6,7,9,10,12號菌種革蘭染色菌體呈紅色,為革蘭陰性菌；而3,ll,14號菌種為革蘭陽性菌。一號菌株的糖發(fā)酵試驗(yàn),吲哚試驗(yàn),甲基紅實(shí)驗(yàn),V.P試驗(yàn),及16S rDNA序列同源性剖析成果,表明一號菌種屬于大腸桿菌屬。 (2)以一號,二號菌株為動身菌株,通過紫外線誘變處理,作出各菌株的存活率曲線圖,找出致逝世率分辨為40％、50％、60％、70％、80％、90％的照耀時(shí)光,分辨依照上述時(shí)光照耀菌液,涂布在纖維素剛果紅造就基上造就,采取透明圈法初篩和搖瓶培育復(fù)篩,獲得了幾株高產(chǎn)纖維素酶的突變株。其中一號菌株經(jīng)紫外線誘變處置的Q3和Q5突變株產(chǎn)酶活氣Zui高,與出發(fā)菌株相比酶活氣進(jìn)步了15.8倍和12.5倍；二號菌株經(jīng)紫外線誘變處置后,變異菌株R6的產(chǎn)酶活性Zui高,是動身菌株的11.9倍。 (3)從甜酒曲的固體培育物中挑選出10個(gè)大小不等的菌落,利用淀粉發(fā)酵試驗(yàn),篩選出發(fā)酵才能較強(qiáng)的S6,S7,S10號酵母菌,以稻草,毛豆殼,玉米棒為原料,應(yīng)用Q3,Q5這兩株誘變優(yōu)秀菌株及S6,S7,S10號酵母菌分離混菌發(fā)酵生物資纖維素。
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