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　　 一、細胞程度上的研究技術

　　(一)光學顯微鏡技術 光學顯微鏡技術(1ight microscopy，LM)是一種常用技術，為了觀察某種細胞和組織，將其取下后，用必定的藥品(單一的或按配方混雜的)固定，使組織中的蛋白質敏捷凝固，以盡可能保留其自然結構，而后經(jīng)一系列的處置，將其包埋在石蠟、火棉膠中，用切片機將組織切成薄片(一般是5～10um)。若是石蠟包埋，則應先脫掉切片上的蠟，然后染色，在顯微鏡下觀察。Zui常用的染料是蘇木精(hematoxylin)和伊紅(eosin)(簡稱H-E)。蘇木精是具有陽離子的堿性染料，可以和組織中陰離子基團親和形成鹽，故凡被蘇木精染成藍紫色的結構和物質則稱為嗜堿性物質。伊紅是具有陰離子的酸性染料，可以和組織中陽離子基團親和形成鹽，故凡被伊紅染成紅色的結構或物質，則稱為嗜酸性物資。對酸性或堿性染料親和力均不強者，則稱為中性物質。

　　此外，還可以把組織直接放于低溫下凍結，然后直接切片、染色，制成標本以便鏡下察看，該種程序能較好的保留酶的活性，且程序簡便、快速，故常用于酶的組織化學研討及病理的快速診斷。

　　血液(或體液等)可直接涂在玻片上(涂片法)進行觀察。一些軟組織(如疏松結締組織、神經(jīng)組織等)可以撕開展在玻片上(展片法)進行觀察。堅硬的骨、牙組織，可以磨成薄片(磨片法)進行觀察。

　　(二)幾種特別顯微鏡

　　1．相差顯微鏡(phase contrast microscope) 未染色的標本不能接收光線，一般光學顯微鏡下觀察這種細胞的結構是艱苦的，觀察活細胞的微細結構通常要采取相差顯微鏡，其原理是通過物鏡里的相板和聚光鏡上增添了環(huán)狀光闌，把透過標本的可見光的光程差(相位差)變成振幅差，從而進步細胞內各結構之間的對照度，使未染色的活組織和細胞內各種結構變得更清楚。

　　顛倒相差顯微鏡(inverted phase contrast microscope) 物鏡在物臺下，透鏡向上，而光源在物臺上，光向下射。該種鏡實用于對培育瓶(皿)內的活細胞進行觀察。

　　2．暗視野顯微鏡(dark-field microscope) 也能對未染色的資料浮現(xiàn)顯明對照。其原理是應用特別的暗視聚光器，遮往中心光束的照明，從側面來的光照耀標本，視野暗，而標本中顆粒所產生的衍射光或散射光進進物鏡，出現(xiàn)出亮點，且十分清楚。因此，可用來觀察未染色的活細胞和膠體粒子，以及某些細胞器，如線粒體、細胞核等。

　　3．熒光顯微鏡(fluorescence microscope) 一般是用高壓汞燈發(fā)生的紫外線為光源，熒光物質受波長較短的紫外線照耀后，可以激發(fā)出波長較長的可見光，后者的波長有賴于發(fā)射物質的化學性質。有些物資對某種熒光染料有特異親和力，如DNA能聯(lián)合吖啶橙，呈黃色或黃綠色熒光，RNA與吖啶橙結合后則產生橘黃或橘紅色熒光。聯(lián)合熒光物資的抗體與抗原結合后，也可以用熒光顯微鏡觀察。

　　(三)一般組織化學技術 用顯微鏡和化學分析兩者結合的方法在切片上研究組織或細胞內化學成分的技術稱為組織化學(histochemistry)或細胞化學。組織化學可以準確檢測組織或細胞內某一化學成分的性質和散布(即定性和定位)，也可以借助儀器進行定量。如欲檢測細胞和組織內的多糖類，可用過碘酸希夫反映(periodic acid Schiff reaction，PAS反響)，多糖經(jīng)高碘

　　酸(HIO4)氧化成多醛，多醛的醛基與無色的Schiff試劑(無色品紅)結合成為紫紅色沉淀物，沉淀物部位則表現(xiàn)多糖存在的部位(圖1-1，式1，2)。

　　再如，欲檢測細胞或組織內的酸性磷酸酶，在酸性條件下，使底物在細胞或組織中的酸性磷酸酶催化下分解，發(fā)生磷酸根，后者再與參加的鉛化合物的鉛離子聯(lián)合，再被硫化銨置換成玄色的硫化鉛沉淀，玄色沉淀部位即表現(xiàn)酶存在的部位(圖1-2)。

　　

　　用組織化學技術可以檢測細胞或組織內的糖類、脂類、蛋白及酶類等。

　　(四)免疫組織化學技術 這是近年來發(fā)展起來的一種新技術，它應用抗體和抗原特異結合的原理，來檢測細胞或組織的多肽或蛋白質等大分子物質。這種物質即為抗原，用它免疫動物可以制備抗該種物質的抗體(抗血清)，也可以用該物質制備單克隆抗體，將這種抗體用熒光染料、鐵蛋白或辣根過氧化物酶等標記，然后用標志的抗體處理組織切片，標記抗體同組織或細胞內相應的抗原特異性結合，因而，在組織切片上浮現(xiàn)有標記物或酶解產物的有色沉淀(酶標記的部位)，即抗原(多肽或蛋白質)存在的部位。用上述標記的抗體與相應抗原結合的辦法，稱為直接法。另一種是間接法：先用某抗原的抗體(第一抗體)作為抗原，免疫另一種動物，制備抗體的抗體，稱抗抗體(第二抗體)，然后對第二抗體進行標志。欲測組織或細胞中某種抗原，先以相應的抗體(第一抗體)處置，抗原與抗體特異結合，而后用標志的抗抗體(第二抗體)處理，它特異地同第一抗體結合，Zui后顯色，鏡檢，顯色的部位即是抗原存在的部位。

　　目前Zui常用的免疫組織化學(immunohistochemistry)辦法，有過氧化物酶-抗過氧化物酶復合物法(peroxidase-anti-peroxidase complex method，PAP法)和抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復合物法(avidin-biotin-peroxidase complex method，ABC法)，這兩種方法均屬間接法。

　　1．PAP法 重要原理是第一抗體同抗原特異結合，第二抗體既能同第一抗體結合，又能同PAP復合物結合。后者是由過氧化物酶和抗過氧化物酶抗體所組成，Zui后顯色反映。該法較直接法和一般間接法敏銳。

　　 2．ABC法 這是近年來發(fā)展起來的方法，其重要原理是第一抗體同抗原特異結合，已結合生物素(biotin)的第二抗體再同第一抗體結合。由于一個分子的抗生物素蛋白(avidin)可以同4個生物素結合，Zui后用結合生物素的過氧化物酶和抗生物素蛋白復合物處置，使復合物同第二抗體(已結合生物素)結合，顯色后，凡顯色的部位即表明抗原存在的部位。該方法比PAP法敏銳20—40倍(圖1-3)。

　　(五)細胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng) 將人體或動物體的細胞或組織在無菌的條件下于合適的溫度、pH、充分的養(yǎng)分進行體外造就稱細胞造就和組織培育(cell culture and tissue culture)。這樣，細胞或組織可以存活。假如將細胞進行克隆(clone)(從一個細胞決裂而來)純化，而且能穩(wěn)固的傳代及存活下往，這種細胞群體稱為細胞系(cell line)。由于細胞系是由一個親本細胞決裂增殖而來，故細胞系的每一個細胞同親本細胞的生物特征雷同。目前國內外樹立了很多種動物和人類的正常細胞和腫瘤細胞系，如Hela細胞系(人宮頸腺癌細胞)、Eca-109細胞系(人食管癌細胞系)、BEL-7402細胞系(人肝癌細胞)等，這給試驗研究供給了有用的資料。如用肝細胞系來研究肝細胞的代謝，可避免用整體肝研究肝細胞時肝內其他細胞對肝細胞功效的影響，使所得成果單一可靠。該種技術是研究性命科學的一種主要手腕，廣泛運用于細胞生物學、生物化學、免疫學和腫瘤學等研究。近些年來，人們利用細胞造就、細胞雜交(兩種不同細胞的融會)方法，做出了不少成就，增進了性命科學的發(fā)展。

　　二、亞細胞程度上的研究技術

　　(一)透射電子顯微鏡技巧 電子顯微鏡與光學顯微鏡不同，它是以電子束取代光源，以磁場取代透鏡，進行聚焦和放大，Zui后將物體的影象投射到熒光屏或照相底片上。依據(jù)辨別率公式：R＝K×λ／NA(K＝常數(shù)0．61，λ：波長，NA：鏡口率)，電子束波長甚短，故電鏡可極大的進步辨別率和放大率，目前電鏡的分辯率可達0.2-0.3nm，可放大幾十萬倍。

　　由于電子易被物體散射和接收，所以組織切片必需非常薄，一般約10～20nm。欲檢測的組織需先經(jīng)藥品固定，樹脂包埋，重金屬鹽處理，然后在超薄切片機上用玻璃刀或鉆石刀切成超薄切片。用透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy，TEM)觀察標本時，電子經(jīng)過被重金屬鹽所染的部位，電子被散射的多，則熒光屏上顯得暗，圖象較黑，稱電子致密，反之，則稱為電子透明(圖1-4)。

　　

　　電壓在500kV以上的電子顯微鏡，稱超高壓電子顯微鏡，其電子束可透過較厚的超薄切片。

　　(二)掃描電子顯微鏡技術 掃描電子顯微鏡技巧(scanning electron microscopy，SEM)可以用來視察細胞或組織表面，斷面和鑄型的構造，在顯示表面形態(tài)時，先將其固定，后在其表面噴鍍金或碳，用掃描電子顯微鏡觀察(圖1—4)。

　　 (三)冷凍蝕刻 冷凍蝕刻(freeze etch)又稱冷凍蝕刻復型(freezeetch replica)。該辦法扼要進程如下：①固定和冷凍掩護：取材固定后，轉移到甘油中，甘油浸進組織，可維護組織避免冷凍時呈現(xiàn)人工假象。②冷凍：將組織切成小塊，浸入液氮凍結。③劈裂：高真空下將組織劈裂。④蝕刻：使溫度略微上升，使劈裂表面冰晶升華，從而涌現(xiàn)自然的凸凹現(xiàn)象。⑤復型：以必定角度向表面噴鍍一層薄的鉑膜，以垂直方向噴一層碳，加固鉑膜。⑥清算復型及電鏡察看；消化組織取下復型，用透射電子顯微鏡視察。固然觀察的標本并非組織本身，而是劈裂面的鉑復型。用此方式可以觀察細胞膜內部兩層脂質分子間的構造(圖1-5)。

　　三、分子程度上幾種重要研討技巧

　　(一)放射性核素和放射自顯影 用放射性核素作示蹤原子，標記某種氨基酸或其他化合物，可以追蹤一些物質在細胞內的合成和其代謝道路，如14C標記的氨基酸可以追索蛋白質的合成，3H-胸苷摻入構成細胞核的DNA，可以研究其細胞周期等。將攝入放射性物質的細胞或組織，做成切片，或將其某一成分分別電泳，利用射線對感光乳膠的作用，曝光后，經(jīng)顯影、定影后，有放射性核素標記的物質處，浮現(xiàn)玄色銀粒，可用肉眼、光鏡或電鏡進行觀察。

　　(二)分子原位雜交 根據(jù)核酸分子上堿基互補原則，在DNA和RNA互補鏈之間進行特異性雜交，此稱為分子原位雜交(in situ hybridization)。借此，可以對組織切片和玻片上的培育細胞的核酸片斷進行檢測和定位。雜交有兩種類型：即對細胞核內的DNA雜交和對胞質內的RNA雜交。用已知核酸片斷［如互補DNA(cDNA)]作為探針，將其標記上放射性核素、熒光素或結合過氧化物酶的生物素，在原位上對細胞和組織內特異的mRNA和rRNA以及DNA(預先在pH8條件下處理標本，使DNA雙鏈裂開)進行雜交，放射自顯影或直接用熒光顯微鏡觀察或酶解底物，出現(xiàn)色彩反映。該方法定位準確，簡便快速，故普遍運用于細胞生物學、組織學和胚胎學。該方法除斷定細胞內特異的mRNA種類外，還有以下用處：①測定濃縮染色體上DNA序列的定位。②測定細胞間期細胞核內常染色質上功效結構特點。③一條染色體上某一區(qū)段的核酸序列的肯定。④測定微量病毒顆粒。⑤對糖蛋白和多肽激素合成的細胞內定位等(圖1-6)。

　　 四、定量分析術

　　在組織、細胞內結構和化學成分定性研究的基本上，對其定量研究是性命科學發(fā)展中所必須的，故定量剖析技術的利用日趨普遍。

　　(一)顯微分光光度定量術 依據(jù)細胞或組織內某種物質含量不同，染色深淺不一，對必定波長的光接收不同，利用顯微分光光度計(microspeetrophotometer)對該物質進行定量測定。由于消光度與物質的厚度和濃度成正比，將消光度經(jīng)過一系列的光電組合體系轉換為電信號，將其放大，測出光密度值進行定量分析。對運用組織化學、免疫組織化學、放射自顯影和原位雜交術制造的標本，均可利用其進行定量分析。

　　(二)形態(tài)計量術 是應用幾何學、統(tǒng)計學原理，肽視察細胞或組織中獲得的二維平面，推導出三維立體定量的方式。這種研究物體內某種結構韻立體數(shù)值之科學稱為體視學(stereology)。通常利用圖象剖析儀(image analyzer)將察看標本通過攝象機顯示于監(jiān)示器屏幕上，并依據(jù)不同構造的色彩深淺(灰度)及各象點的大小、地位，測定出其體積、表面積、周長、均勻厚度、數(shù)目、散布等參數(shù)，使形態(tài)學的研討更有可比價值。

　　(三)流式細胞術 將受檢細胞制成懸液，再用熒光染色，然后使這種單細胞懸液快速通過流式細胞計(flow cytometry)的激光照耀小區(qū)，將每個細胞發(fā)生的熒光信號變成電信號，輸進盤算機內，即可測得該組細胞中不同細胞的數(shù)目、熒光強度、細胞體積及細胞內結構的含量等參數(shù)。由于該方式速度快、準確度高，已普遍利用于細胞周期、DNA、RNA、抗體、受體等方面之剖析。

　　胚胎移植，核移植


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