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　　植物葉綠體的分離及熒光觀察

　　葉綠體足植物細胞所特有的能量轉(zhuǎn)換細胞器，光合作川就是在葉綠體中進行的。由于具有這一主要功效，所以它一直是細胞生物學(xué)、遺傳

　　葉綠體足植物細胞所特有的能量轉(zhuǎn)換細胞器，光合作川就是在葉綠體中進行的。由于具有這一主要功效，所以它一直是細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的主要研討對象。葉綠體是植物細胞中較大的一種細胞器，應(yīng)用低速離心即可分別集中進行各種研討。

　　試驗?zāi)繕?

　　 一、通過植物細胞葉綠體的分離。懂得細胞器分離的一般原理和方式。

　　二．視察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光．井熟習(xí)熒光顯微鏡的應(yīng)用方式。

　　試驗原理將組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進行差迷離心，是分離細胞器的常用辦法，一個顆粒在離心場中的沉降速率取決于顆粒的大小、外形和密度，也同離心力以及懸浮介質(zhì)的粘度有關(guān)。在一給定的離心場中，同一時光內(nèi)，密度和大小不同的顆粒其沉降速度不同。依次增添離心力和離心時間，就能夠使非均一懸浮中的顆 粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部．分批收集即可獲得各種亞細胞組分。

　　葉綠體的分別應(yīng)在等滲溶液(0.35mol/L氯化鈉或0.4moJ/L蔗糖溶液)中進行，以免滲透壓的轉(zhuǎn)變使葉綠體受到損傷。將勻漿液在1000r/min的條件下離心2min，以往除其中的組織殘渣和一些未被破碎的完全細胞。然后，在3000r/min的條件下離心5mia，即可獲得沉淀的葉綠體(混有部分細胞核)。分離進程Zui好在0?5℃的條件下進行：假如在室溫下，要敏捷分離和察看。

　　熒光顯微術(shù)是應(yīng)用熒光顯微鏡對可發(fā)熒光的物資進行觀察的一種技巧。某些物資在?定短波長的光(如紫外光)的照耀下接收光能進進激發(fā)態(tài)，從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時，就能在極短的時光內(nèi)放射出比照耀光波長更長的光(如可見光)，這種光就稱為榮光．若結(jié)束供能熒光現(xiàn)象立即停滯。有些生物體內(nèi)的物質(zhì)受激發(fā)光照耀后直接發(fā)出熒光，稱為自發(fā)熒光(或直接熒光)，如葉綠索的火紅色熒光和水質(zhì)素的黃色熒光等。有的生物資料本身不發(fā)熒光，但它接收熒光染料后同樣也能發(fā)出熒光，這種熒光稱為次生熒光(或間接熒光)，如葉綠體吸附吖啶橙后可發(fā)桔紅色熒光。

　　利用熒光顯微鏡對可發(fā)熒光物資進行檢測時，將受到很多因素的影響，如溫度、光、淬滅劑等。因此在熒光觀察時應(yīng)抓緊時光，有必要時立即拍照。另外，在制造熒光顯微標本時Zui好應(yīng)用無熒光載玻片，益玻片和無熒光油。

　　實驗用品

　　 一、器材

　　1、重要裝備：普通離心機、組織搗碎機，粗天平、熒光顯微鏡。

　　2、小型器材，500ml燒杯2個，250ml量筒1個，滴管10支，10ml刻度離心管20支，紗布若干，無熒光載片和蓋片各4片。

　　二、資料

　　新穎菠菜。

　　三、試劑

　　0.35mol/L氯化鈉溶O.01%吖啶橙(acridine orange)。

　　實驗辦法

　　1、選取新穎的嫩菠菜葉，洗凈擦干后往除葉梗及粗脈，稱30g于150ml0.35mol/L NaCI溶液中，裝進組織搗碎機，顯微鏡品牌排行。

　　2、應(yīng)用組織搗碎機低速（5000r/min）勻漿3?5min。

　　3、將勻漿用6層紗布過濾于500ml燒杯中。

　　4、取濾液4ml在1000r/min下離心2min。棄去沉淀。

　　5、將上沾液在3000r/min下離心5rmin．棄往上清液，沉淀即為葉綠體(混有部分細胞陔)。

　　6、將沉淀用0.35mol/LNaCI溶液懸浮。

　　7、取葉綠體懸液一消滴于載片上，加蓋片后即可在普通光鏡和熒光顯微鏡下視察。

　?、僭谄胀ü忡R下觀察。

　?、谠跓晒怙@微鏡下觀察。

　　③取葉綠體懸液一滴滴在無熒光載片上，再漓加一滴0.01%吖啶橙熒光染料，加無熒光蓋片后即可以熒光顯微鏡下觀察。

　　菠菜葉手切片視察

　　用剖須刀將新穎的嫩菠菜切削一斜面置于載片上，滴加1--2滴0.35mol/LNaCI溶液，加蓋片后輕壓，置顯微鏡下觀察。

　?、僭谄胀ü忡R下觀察。

　?、谠跓晒怙@微鏡下觀察。

　　③用同樣方式制片，但滴加I--2滴0.01%吖啶橙染液染色lmin，洗去余液，加蓋廾后即町以熒光顯微鏡下觀察。

　　試驗成果

　　一、葉綠體的分別和察看

　　1、普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形，在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒，即基粒。

　　2、以Olympus熒光顯微鏡為例，在選用B(blue)激發(fā)濾片，B雙色鏡和O530(orange)阻斷濾片的條件下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光。

　　3、參加吖啶橙染色后，葉綠體可發(fā)出桔紅色熒光，而其中混有的細胞核則發(fā)綠色熒色。

　　二、菠菜葉手切片察看

　　1、在普通光鏡下可以看到三種細胞

　　(1)表面細胞：為邊沿呈鋸齒形的鱗片狀細胞。

　　(2)捍衛(wèi)細胞：為構(gòu)成氣孔的成對存在的腎形細胞。

　　(3)葉肉細胞：為排成柵狀的長方形和橢幽形細胞。

　　葉綠體呈綠色橄欖形，在高倍鏡下還可以看到綠色的基粒。

　　2、在熒光顯微鏡下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光，但其熒光強度要比游離葉綠體弱。氣孔發(fā)綠色熒光，兩捍衛(wèi)細胞內(nèi)的火紅色葉綠體則圍繞氣孔排列成一圈。表皮細胞內(nèi)葉綠體數(shù)目要比葉肉細胞少。

　　3、用吖啶橙染色后，葉綠體則發(fā)出枯紅色熒光，細胞核町發(fā)出綠色熒光，氣孔仍為綠色。