一、光學(xué)
顯微鏡油鏡的應(yīng)用和維護(hù)法：
由于細(xì)菌體積渺小，故在細(xì)菌的形態(tài)學(xué)研討中，經(jīng)常須要借助顯微鏡油鏡，才干比擬明白地進(jìn)行視察。因此，同窗們必需熟練地控制油鏡的應(yīng)用及維護(hù)法。
（一）油鏡頭的辨認(rèn)：
各接
物鏡的放大率可由其外形識別，鏡頭長度越大，鏡片直徑越小，放大倍數(shù)大；反之，放大倍數(shù)小。油鏡頭長度大于低、高倍鏡，鏡頭下緣一般刻有一圈黑線或白線，并刻有100×、1.25或oil等字樣。
?。ǘ┯顽R的使用法：
1、
使用顯微鏡油鏡時(shí)，必需將顯微鏡端正派立桌上，不得將鏡臂曲折，使載物臺傾斜，以免香柏油流溢，影響觀察，污染臺面。
2、對光：
采取自然光為
光源時(shí)，宜用平面反光鏡；若用人工燈光時(shí)，則用凹面鏡。
首先打開光圈，轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡，使光線集中于集光器?？梢罁?jù)須要，高低移動(dòng)集光器和縮放光圈，以獲得Zui佳光度。
一般用低倍鏡或高倍鏡察看物象或用油鏡檢討不染色標(biāo)本時(shí)，需降落集光器并恰當(dāng)?shù)乜s小光圈，使光度削弱；若用油鏡檢討染色標(biāo)本時(shí)，光度宜強(qiáng)。應(yīng)將
顯微鏡亮度開關(guān)調(diào)至Zui亮，光圈完整打開，集光器上升至與載物臺相平。
3、調(diào)焦距：
A、將標(biāo)本片放載物臺上，用標(biāo)本推動(dòng)器固定，將欲檢部分移至接物鏡下。先用低倍鏡找出標(biāo)本的地位，然后進(jìn)步鏡筒，在標(biāo)本的待檢部位滴鏡油一滴，再換油鏡觀察。
B、轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器使載物臺漸漸上升（或使鏡筒漸漸降低），直至油鏡頭浸沒至油中。此時(shí)眼睛應(yīng)從側(cè)面觀察，以免壓碎標(biāo)本片和破壞鏡頭。
C、然后雙眼移至接
目鏡，一面從接目鏡觀察，一面反方向遲緩地轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器（降落載物臺，或上升鏡筒），當(dāng)呈現(xiàn)含混物象時(shí)，換用細(xì)調(diào)節(jié)器，轉(zhuǎn)動(dòng)至物象清楚為止。
D、觀察完畢，應(yīng)先進(jìn)步鏡筒，并將油鏡頭扭向一側(cè)，再取下標(biāo)本片。油鏡頭使用后，應(yīng)立即用擦鏡紙擦凈鏡頭上的油。若鏡油粘稠干結(jié)于鏡頭上，可用擦鏡紙蘸少許二甲苯擦拭鏡頭，并隨即用干的鏡紙擦去殘存的二甲苯，以免二甲苯滲透，溶解用以粘固透鏡的膠質(zhì)物，造成鏡片移位或脫落。
?。ㄈ┯顽R的使用原理：
油鏡的透鏡很小，光線通過玻片與油鏡頭之間的空氣時(shí)，因介質(zhì)密度不同，產(chǎn)生折射或全反射，使射入透鏡的光線減少，物象浮現(xiàn)不清。若在油鏡與載玻片之間參加和玻璃折射率（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515），則使進(jìn)入透鏡的光線增多，視野亮度加強(qiáng)，使物象明亮清楚。
?。ㄋ模╋@微鏡的保護(hù)：
1、顯微鏡是精密儀器，使用時(shí)要注意愛惜，切勿隨便拆卸和碰撞。
2、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氯仿、酒精、乙醚等都能往漆或破壞機(jī)件，均需注意不使接觸顯微鏡。
3、細(xì)調(diào)節(jié)器是顯微鏡Zui精致、Zui懦弱的機(jī)械部分，每旋轉(zhuǎn)一周使鏡筒上升或降低0.1毫米，只能往返回轉(zhuǎn)，即向一個(gè)方向轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)周遇阻力時(shí)，應(yīng)反方向轉(zhuǎn)動(dòng)。
4、不用時(shí)將接物鏡轉(zhuǎn)成“八”字形，載物臺降至低點(diǎn)，降落集光器，關(guān)上光圈，套上維護(hù)罩，雙手平托送回。
5、
顯微鏡使用進(jìn)程中，如發(fā)明問題應(yīng)及時(shí)向老師報(bào)告并進(jìn)行登記，以便檢驗(yàn)。
二、細(xì)菌的染色檢查法
一般染色法分為單染色法和復(fù)染色法。單染色法只用一種染料使細(xì)菌著色，可明白觀察細(xì)菌形態(tài)，但不能辨別細(xì)菌。復(fù)染色法是用兩種以上染料進(jìn)行染色，有協(xié)助辨別細(xì)菌的作用，故又稱為辨別染色法。復(fù)染色法種類很多，重要有革蘭染色法和抗酸染色法。
?。ㄒ唬┘?xì)菌涂片的制備
作細(xì)菌染色檢討，首先要制備細(xì)菌涂片。制備細(xì)菌涂片一般包含涂片、干燥、固定三步。
1．涂片：取干凈玻片一張，按以下步驟操作
肉湯培養(yǎng)物涂片：
?、?右手拿接種環(huán)的玄色膠柄部分，左手托持試管。
?、?接種環(huán)以15°角置于酒精燈的外焰中燒灼滅菌，直至金屬絲燒紅(圖1-3)，然后將金屬柄部也盤旋通過分焰燒灼滅菌。
?、?用右手小指和手掌小魚肌側(cè)拔掉左手所持試管的棉塞，并立即火焰燒灼試管口滅菌。
?、?用已滅菌冷卻的接種環(huán)伸進(jìn)試管中取出菌液(圖1-4)。注意勿使沾有菌液的接種環(huán)觸及試管壁及試管口。
?、?再次滅菌試管口，將棉塞在火焰上略加燒灼（時(shí)光要短，以免點(diǎn)燃棉塞），塞好棉塞，放回原處。
⑥ 將接種環(huán)上之菌液涂于載玻片上，制成的菌膜直徑約1cm左右。然后將接種環(huán)用火焰燒灼滅菌。為防止細(xì)菌濺散污染環(huán)境，接種環(huán)滅菌前，須先將接種環(huán)靠近火焰或放內(nèi)焰中烤干，然后再在外焰中燒紅滅菌，殺逝世殘留的細(xì)菌。液體標(biāo)本（如膿液、痰液等）均可照此法涂片
斜面培養(yǎng)物涂片：
用細(xì)菌斜面（或平板）培養(yǎng)物涂片，需預(yù)先取一接種環(huán)無菌生理鹽水置于載玻片上，然后再按上述無菌操作法從斜面培養(yǎng)物上取少量菌苔，放入生理鹽水內(nèi)輕輕研勻，制成直徑lcm左右的菌膜。
如有多個(gè)標(biāo)本行同一辦法染色時(shí)，可用蠟筆在玻片上劃出數(shù)格，做好標(biāo)志再分辨進(jìn)行涂片，以免混雜。
2、干燥：
涂片Zui好在室溫中自然干燥，如需加速干燥，可將標(biāo)本向上警惕地放置離火焰半尺高處，略烘促使干燥，切不可在火焰上燒干。
3、固定：
常用加熱固定法。涂片干燥后，讓玻片有菌膜的面向上，在火焰的Zui熱部分敏捷通過三次。固定之目標(biāo)是使細(xì)菌蛋白變性，菌體堅(jiān)固黏附于玻片上，還可殺逝世細(xì)菌，轉(zhuǎn)變菌體對染料的通透性。
以上步驟完成后，便可進(jìn)行各種染色。
?。ǘ└锾m（Gram）染色法
革蘭染色是細(xì)菌學(xué)中應(yīng)用Zui普遍的一種染色方式，籍此染色法，可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類。
【材料】金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大腸桿菌(Escherichia coli，E．coli)24h斜面培養(yǎng)物、革蘭染色液、生理鹽水、載玻片、接種環(huán)等，
生物顯微鏡價(jià)格。
【方法】
1、初染：玻片菌膜上滴加結(jié)晶紫染液1～2滴，染色1分鐘，用細(xì)流水沖冼剩留染液，甩往片上積水。
2、媒染：加盧戈碘液處置1分鐘后細(xì)流水沖刷，甩往積水。
3、脫色：加95％酒精2～3滴，輕輕動(dòng)搖玻片，使脫色均勻，一般處置約30秒左右，細(xì)流水沖洗，甩去積水。
4、復(fù)染：加稀釋石炭酸復(fù)紅液1～2滴，染30秒鐘，細(xì)流水沖刷，待干或用濾紙吸干，油鏡察看。
【成果】葡萄球菌染成紫色，為革蘭陽性，以G+表現(xiàn)；大腸桿菌染成紅色，稱革蘭陰性，以G-表現(xiàn)。
【注意事項(xiàng)】
1、脫色是革蘭染色中的要害步驟，脫色過度，可使G+菌被誤染為G- 菌；脫色不夠，則G- 菌可被誤染為G+菌。脫色時(shí)光的是非還與涂片厚薄有關(guān)，一般以涂片薄而均勻?yàn)楹谩?
2、G+菌與G- 菌的染色反映，還受多種因素如菌齡、染色時(shí)光、pH等的影響，只有嚴(yán)厲正規(guī)操作，才干得到準(zhǔn)確結(jié)果。
【附錄】
革蘭染色液的配制
1、結(jié)晶紫染液
① 結(jié)晶紫酒精飽和液：取14g結(jié)晶紫溶于100ml 95％的酒精內(nèi)。
?、?１％草酸銨水溶液：草酸銨0.8g溶于80ml蒸餾水中。
?、?將已配好之①液20ml和②液80ml混雜即成，置瓶中備用。
2、蘆戈（Lugol）氏碘液
?、?碘 1g；碘化鉀 2g ；蒸餾水300ml
?、?先將碘化鉀2g溶于100ml蒸餾水中，再加碘1g，用力搖勻待溶解后，加蒸餾水至300ml即成。供革蘭染色媒染用。
3、95％酒精
4、石炭酸復(fù)紅稀釋液
?、偈克釓?fù)紅染液：
取堿性復(fù)紅酒精飽和液（95％酒精100毫升中加堿性復(fù)紅10g）10ml，與5％石炭酸水溶液90ml混勻即成。
②稀釋石炭酸復(fù)紅染液：
將上述石炭酸復(fù)紅染液用蒸餾水稀釋10倍即成。
上述各種染液配成后，均需用濾紙過濾后使用，染液應(yīng)貯存于棕色瓶內(nèi)。
?。ㄈ┛顾崛旧?
【方法】
?。?）在制好的涂片標(biāo)本上滴加石炭酸復(fù)紅液3-4滴，用木夾夾住玻片一端，在酒精燈上漸漸加熱，使染液冒蒸汽，但不能煮沸，并隨時(shí)添加染液，使不要烤干，保持5分鐘。
?。?）待玻片冷卻后，水沖刷 。
?。?）用3%鹽酸酒精脫色至涂面無色為止，用流水輕輕沖洗。
?。?）加美蘭染色液 1-2滴，復(fù)染30秒-1分鐘，水洗干燥，鏡檢。
【成果觀察】
抗酸細(xì)菌（如結(jié)核桿菌）呈紅色，其它細(xì)菌及背景物資均為藍(lán)色。必需逐一觀察各個(gè)視野，直到全體涂片找不到結(jié)核桿菌時(shí)，才可報(bào)告陰性。
三、細(xì)菌的接種技巧和培養(yǎng)辦法：
?。ㄒ唬┘?xì)菌的接種技巧
接種技巧一般分為分別培育接種法和純種細(xì)菌接種法。
1、分別培養(yǎng)接種法---平板劃線法：
被檢資料如糞便、痰、膿汁、尿液、腦脊液等?；煜卸喾N細(xì)菌，平板劃線法可使混淆的細(xì)菌在瓊脂平板表面疏散生長，各自形成不同的菌落，再根據(jù)菌落的形態(tài)特點(diǎn)，挑選單個(gè)菌落持續(xù)培養(yǎng)，以此分別獲得純種細(xì)菌，用于進(jìn)一步研討、鑒定或保留。
平板劃線的方式依據(jù)待檢標(biāo)本中細(xì)菌的數(shù)目來選擇，可分為平行劃線法和分區(qū)劃線法兩大類。
【資料】葡萄球菌和大腸桿菌混雜菌液、普通瓊脂平板。
【方法】
?。?） 平行劃線法：
常用于含菌量較少的標(biāo)本。
?、贌平臃N環(huán)，待冷，取一接種環(huán)菌液。左手斜持平皿（450角），用拇指打開皿蓋，使其與皿底間離開成2～3cm寬的縫隙，靠近火焰四周，右手握持沾菌之接種環(huán)伸入皿內(nèi)，在平皿上端1/6范疇往返劃線，密集涂布。
②燒灼接種環(huán)，待冷后（是否冷卻可在平板培養(yǎng)基邊沿?zé)o菌處接觸一下，若瓊脂溶化表現(xiàn)尚未冷卻），通過原劃線處作持續(xù)平行劃線（如圖2-1A）。劃線時(shí)使接種環(huán)與平板成300～400角，輕觸平板，用腕力將接種環(huán)在平板表面行輕快的滑移動(dòng)作往返劃線，劃線間距恰當(dāng)，不能重疊，接種環(huán)也不能嵌進(jìn)培養(yǎng)基內(nèi)劃破瓊脂表面，并注意無菌操作，避免空氣中的細(xì)菌污染。
?、劢臃N完畢后，蓋皿蓋，將接種環(huán)火焰滅菌后放回，用記號筆在皿底玻璃上注明標(biāo)本名稱，接種者班級、姓名、日期等，將造就皿顛倒（平皿底面朝上，以避免培育進(jìn)程中凝結(jié)水自皿蓋滴下），送進(jìn)溫箱。
④經(jīng)37℃18～24小時(shí)孵育后取出，察看瓊脂平板表面細(xì)菌生長情形，注意菌落的特點(diǎn)。
?。?） 分區(qū)劃線法：
常用于含菌量較多的標(biāo)本。
?、偻戏ㄍㄟ^原劃線處作銜接平行劃線，劃線范疇占平板的1/3～1/5；種畢, 旋轉(zhuǎn)平板，接種環(huán)用火焰滅菌，冷卻，再通過前一段劃線在平板另1/3～1/5面積內(nèi)作持續(xù)平行劃線；如此反復(fù)3～5次。
②接種完畢后，蓋皿蓋，接種環(huán)火焰滅菌后放回。同上在皿底玻璃上注字后，將培養(yǎng)皿顛倒，送進(jìn)溫箱培養(yǎng)，37℃18～24小時(shí)后取出，視察菌落特點(diǎn)。
2、純種細(xì)菌接種法
依據(jù)培養(yǎng)基的物理性狀，純種接種法有斜面培養(yǎng)基接種法，液體培養(yǎng)基接種法和半固體培養(yǎng)基接種法三類。
【資料】葡萄球菌或大腸桿菌18～24小時(shí)斜面培養(yǎng)物各一支、固體瓊脂斜面培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基、半固體瓊脂培養(yǎng)基。
【辦法】
?。?）固體斜面造就基接種法：
①左手握持菌種管與待種培養(yǎng)管的下端，使斜面部向上，兩管口平齊。在火焰旁，以右手手掌與小指、小指與無名指分辨拔取并夾持兩管棉塞，并將兩管管口敏捷通過分焰滅菌。
②右手執(zhí)接種環(huán)（姿態(tài)與握鉛筆類似）火焰燒灼滅菌，欲伸入試管內(nèi)的接種桿部分，亦要通過火焰3次以殺滅其表面的雜菌。滅菌過的接種環(huán)要握持手中，勿再碰及其它物品。
③將滅菌并已冷卻的接種環(huán)伸入菌種管，從斜面上挑取菌苔少許，退出菌種管，再伸進(jìn)待種管中，自斜面底部輕輕向頂端劃一直線，然后自下而上沿斜面蜿蜒劃線，注意劃線時(shí)勿劃破培養(yǎng)基表面，沾菌的接種環(huán)，進(jìn)出試管時(shí)，均不應(yīng)觸及試管內(nèi)壁。（如圖2-2）。
④接種完畢，兩管管口敏捷通過火焰2～3次，塞回棉塞，并以右手拇指、食指分離將兩管棉塞轉(zhuǎn)進(jìn)至本來地位。接種環(huán)滅菌后送回。接種管注字后37℃孵育18～24小時(shí)后觀察生長情形。
?。?）液體造就基接種法：
基礎(chǔ)上同固體斜面接種法，不同處，僅在取菌后，接種環(huán)應(yīng)在液體培養(yǎng)基管接近液面的管壁處輕輕研磨均勻，然后將試管稍傾斜，使菌種混勻于肉湯中即可。
?。?）半固體培養(yǎng)基接種法：
?、偻戏ㄎ蘸镁N管及半固體培養(yǎng)基管。
?、谟沂治粘纸臃N針，滅菌冷卻后，以針挑取菌苔，垂直刺入半固體瓊脂培養(yǎng)基的中心，可刺達(dá)近管底處，但不觸及管底，然后循原路退出。
?、劢臃N畢，管口通過分焰滅菌，塞上棉塞，接種針滅菌后放回。
上述純種細(xì)菌接種后，均要在試管上注明菌名、接種者姓名、日期，送進(jìn)37℃溫箱，培養(yǎng)18～24小時(shí)后視察生長情形。
四、細(xì)菌抗衡生素的敏感性實(shí)驗(yàn)---紙片擴(kuò)散法
又稱Bauer-Kirby法。是將干燥的浸有必定濃度抗菌藥物的濾紙片放在已接種必定量某種細(xì)菌的瓊脂平板上，經(jīng)培育后，可在紙片四周呈現(xiàn)無細(xì)菌生長區(qū)，稱抑菌圈。丈量抑菌圈的大小，即可判定該細(xì)菌對某種藥物的敏感水平。體外藥敏成果可作為病人治療選用藥物的參考。
【材料】金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌18～24小時(shí)培養(yǎng)物、普通瓊脂平板、小鑷子；含有青霉素、慶大霉素、紅霉素、復(fù)合磺胺、鏈霉素等抗生素的干燥濾紙片。
【方式】
1、將金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌培養(yǎng)物密集均勻地涂布全部平板。
2、將含有抗生素藥物的濾紙片用燒灼滅菌的鑷子分辨貼于平板表面，相互間應(yīng)間隔必定間隔。
3、37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察結(jié)果。
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