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　　犬瘟熱疾病綜合診斷

　　2004年11月23日 點擊：137次

　　　

　　犬瘟熱是由副粘病毒科麻疹病毒屬犬瘟熱病毒（Canine distemper virus,CDV）引起的犬科、鼬科、浣熊科等多種動物的一種急性、熱性、高度接觸性沾染病顯微鏡。該病在臨床上以雙相熱性、卡他性鼻炎及隨后引起的支氣管炎、卡他性肺炎、嚴重的胃腸炎和神經(jīng)癥狀為主要特點，少數(shù)病犬可見下腹部膿性皮疹及足墊角化過度。發(fā)病率幾乎達100%，死亡率達30~80%不等，素有“毀滅性沾染病”之稱電子顯微鏡。由于本病經(jīng)常引起混雜感染及繼發(fā)感染，給經(jīng)濟動物養(yǎng)殖業(yè)造成宏大的經(jīng)濟喪失。要減少犬瘟熱病造成的經(jīng)濟喪失，盡早采用防治辦法，因此對該病的診斷尤為主要。

　　1 臨床診斷

　　臨床診斷重要通過本病的風行特色、臨床特點及類癥病的辨別。

　　1.1 風行特色 在自然條件下可感染多種犬科野生食肉獸，如小熊貓、貉、貂、黃鼠狼，以及豺、狼、獾等。本病一年四季都可產(chǎn)生，冬春季多發(fā)。6月齡以內(nèi)的幼犬特殊易感染，癥狀典范，死亡率極高。世界各地都有風行。

　　1.2 臨床癥狀 體溫呈雙相熱型。病初以呼吸道炎癥為主，表示為流涕、打噴嚏、咳嗽，常為干咳，嚴重時鼻鏡龜裂，呼出惡臭氣體，流膿性鼻液，堵塞鼻孔，張口呼吸呈腹式。肺部聽診，支氣管音粗厲，聞干性羅音或濕性羅音或捻發(fā)音?？梢曊衬ぐl(fā)紺，眼瞼四周有散性出血點，眼瞼干燥，呈膿性眼結(jié)膜炎，角膜潰瘍，甚至穿孔。若以消化道炎癥為主時，重要表示為食欲不振或廢盡，嘔吐，腹瀉，排出帶有黏液的稀便，有時帶有血液。在后期呈現(xiàn)非化膿性腦炎并導致神經(jīng)癥狀，流涎，空嚼，有時全身肌肉振顫，轉(zhuǎn)圈，共濟失調(diào)，口吐白沫，牙關(guān)緊閉，Zui后抽搐而逝世電子顯微鏡。

　　1.3 臨床類癥辨別 犬瘟熱在臨床上輕易與感冒、呼吸道疾病、胃腸炎、犬渺小病毒性腸炎、沾染性肝炎等相混雜，依據(jù)其臨床特點與犬瘟熱進行初步辨別診斷。單純性胃腸炎時，無雙相熱型、無鼻、眼分泌物等。傳染性肝炎時，有黃疸等。犬渺小病毒性腸炎嘔吐激烈、頻繁、飲水后立即產(chǎn)生嘔吐，渴欲強烈，排出的番茄汁樣血便次數(shù)多、數(shù)目大。感冒時體溫升高，無雙相熱型，鼻流清涕，無流淚現(xiàn)象。而犬瘟熱雙相熱型，眼、鼻有分泌物，嚴重時有膿性分泌物；病犬飲水后較少產(chǎn)生嘔吐，初便秘，后腹瀉，糞便稀薄、惡臭，有時混有氣泡和血液；鼻、足墊過度角化；末期常呈現(xiàn)腹痛、肌肉振顫等神經(jīng)癥狀，甚至驚厥直至逝世亡永新。

　　2試驗室慣例診斷

　　2.1包涵體檢討 包涵體重要存在于膀胱、膽管、膽囊、腎盂上皮細胞內(nèi)。取干凈載玻片，滴加生理鹽水1滴，用小刀在膀胱黏膜上刮取上皮細胞，與生理鹽水混雜研勻，制成涂片，置空氣中自然干燥后，用甲醇固定，蘇木精-伊紅染色后鏡檢。細胞核染成藍紫色，永新，細胞漿呈淡玫瑰色，包涵體被染成紅色。包涵體大多在胞漿內(nèi)，1個細胞內(nèi)可能含有1~10個多形性包涵體，但一般浮現(xiàn)圓形或橢圓形。程世鵬等（1999）分辨對用強毒攻毒、注射犬瘟熱疫苗和正常狐貉進行檢查，成果用強毒攻毒的狐貉發(fā)明了膀胱黏膜涂片中有包涵體的存在，而注射犬瘟熱疫苗組和正常對比組則無包涵體的存在，對于臨床發(fā)病動物檢查同樣可檢查出包涵體的存在電子顯微鏡。

　　2.2 Dot-ELISA法診斷 金鑫等（2000）用樹立的三抗體夾心法Dot-ELISA檢測犬瘟熱病毒（CDV）抗原，其抗原Zui低檢出量為1.15ug/ml (0.57625ng/點)，經(jīng)與慣例ELISA對104份自然感染犬的血液白細胞樣本，60份眼結(jié)膜分泌物樣本，73份脾、肝、淋巴結(jié)等臟器樣本

　　作者簡介：歐陽素貞（1955-），女，河南內(nèi)黃人，本科，副教授，從事獸醫(yī)微生物教學和研討工作。

　　進行檢測，檢測的陽性率分離為92.31%、66.67%、83.56%和 90.72%、63.29%、81.86%；

　　兩種辦法檢出的總陽性率分辨為83.54% (198/237)和80.17% (190/237)，總陽性符合率為95.96%，表明兩者呈高度正相干 (r=0.92, P<0.01)。經(jīng)電子永新察看驗證比擬，三抗體夾心法Dot-ELISA檢測的可信度為 94.74%[6]。

　　2.3免疫組化法診斷 免疫組化技術(shù)是在抗原抗體特異反映存在的條件下，借助免疫化學的手腕，檢測抗原（或抗體）在組織細胞內(nèi)存在部位的一門新技術(shù)，目前已普遍運用于人及動物傳染病的病原鑒定和快速診斷，極大地進步了傳染病的診斷和防治程度。

　　Gathumbi等 (1993)研討證實，從腦、脊髓、肺、腸、膀胱、脾和淋巴結(jié)中均可檢出 CDV抗原，其中中樞神經(jīng)體系和肺是診斷的Zui佳組織，脫髓鞘性腦炎和肺炎是犬瘟熱的主要病變永新。Miry等 (1983)采用過氧化物酶法（PAP）技巧檢查患犬瘟熱性肺炎的病犬組織，以為有病變的臟器組織均可檢出CDV抗原，且敏感性顯明高于包涵體檢查電子顯微鏡。Mitchell等 (1991)采取PAP和單抗技術(shù)證實了試驗性感染CDV脫髓鞘性腦炎病犬的腦組織中，不論是脫髓鞘部位還是未見顯著病變的白髓的神經(jīng)膠質(zhì)細胞中均可見到病毒抗原。陽性細胞包含星狀細胞、神經(jīng)元細胞、室管膜細胞、脈絡(luò)叢細胞、腦膜細胞和血管四周的炎性細胞[9]。

　　Kristensen等 (1978)采用免疫熒光（IF）技術(shù)研討了患犬瘟熱性腦炎病犬的CDV散布情形，成果從全體病犬的腦組織中均檢出CDV抗原，在灰質(zhì)和白質(zhì)中均可見到病變。在灰質(zhì)中，抗原主要散布于神經(jīng)元細胞中，包涵體呈成堆的大的顆粒樣或細小顆粒狀或粉塵樣湊集在胞漿中；在白質(zhì)中主要存在于星狀細胞中[10]。Liu等(1957)采取IF技術(shù)證實，在人工感染CDV后3~4天，即可從循環(huán)血單核細胞中檢出CDV抗原，病犬第一次發(fā)熱時Zui具傳染性[11]。

　　2.4 犬瘟熱病毒的分離和鑒定

　　2.4.1病料的采集 采用何種病料，應依據(jù)疾病的類型和病情的發(fā)展情形而定。在體溫開端上升的病毒血癥早期，淋巴組織的沾染Zui為嚴重，因此Zui好從淋巴細胞和淋巴組織分離病毒。對于急性病獸或急性死亡動物，病毒散布于全身各器官，故應從臟器中分離病毒。在慢性病例或疾病的中后期多從腎臟或腦組織分離病毒。

　　2.4.2病毒分別 犬瘟熱病毒能夠適應雞胚和多種組織細胞培育物，但并非所有毒株都能生長良好。犬瘟熱病毒通過絨毛尿囊膜接種9~11日齡雞胚，經(jīng)3~10代后，于接種后5~7天絨毛尿囊膜增厚，有的可引起豆斑。有報道以為，分別犬瘟熱病毒Zui好的方式是用犬和貂的巨噬細胞造就物，接種2~3天后呈現(xiàn)圓形多核巨細胞。巨細胞輕易脫落，而且并非所有的細胞都形成巨細胞，故應多次細心察看。

　　2.3.3病毒的鑒定 通過[7]檢討、酶標SPA染色和瓊脂擴散實驗等方式進行病毒鑒定。電鏡下察看可見犬瘟熱病毒粒子浮現(xiàn)多形性，多數(shù)為球形，病毒粒子的直徑為110~550nm之間。核衣殼呈螺旋狀，總長度為1000nm，螺旋直徑15~19nm，螺旋中心5nm的孔，螺距5~6nm，核衣殼由囊膜包裹，其內(nèi)部為M，厚約5nm，表面為H和F兩個糖蛋白組成的纖突，纖突長度為9nm[8]。

　　遇秀玲等（1998）利用酶標SPA（葡萄球菌A蛋白）染色法對接種CDV的Vero細胞進行染色后發(fā)明，有相應CDV抗原部位，同樣滴加CDV陽性血清的對比細胞片，未見相應反應。CDV MD- 77株沾染后 3、6、9、12 h，胞漿可見渺小陽性顆粒（呈淡黃色至棕褐色著染）；1天后陽性反響顯明加強，多見于胞漿，胞漿亦可見大空泡；2后天壞死細胞呈強陽性反映，細胞間拉網(wǎng)；3~4天后合胞體細胞呈強陽性反響，壞死細胞呈棕褐色至黑褐色；5天后陽性反應主要見于新生細胞胞漿；6天后合胞體細胞呈大圓形，陽性反映主要見于胞漿；7天后全部合胞體細胞呈一棕褐色大團塊；8天后大部分細胞脫落，殘留細胞呈強陽性反響[12]。

　　任文陟等（1994）應用犬瘟熱雞胚成纖維細胞弱毒疫苗免疫動物制備了瓊脂擴散抗體，并對患犬瘟熱病貉肝臟中的抗原進行檢測，與電鏡成果相比擬，陽性符合率達85.7%，陰性符合率為75%，以為是一種較為特異、敏感、操作簡便的辦法[13]。

　　3分子生物學診斷

　　隨著分子生物學技巧的飛速發(fā)展，尤其是分子遺傳學的提高，大大進步了病毒的診斷程度，特殊是核酸雜交、PCR技巧的利用，大大進步了疾病診斷的正確性、敏感性和特異性。

　　李金中等（1999）直接從逝世亡大熊貓肝臟提取細胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后用犬瘟熱病毒的1對引物擴增出了約320bp的片斷。此產(chǎn)物經(jīng)純化、序列剖析表明，其片斷2個引物間長度為281bp，與預計片斷大小雷同。此毒株在核苷酸和氨基酸程度與北京犬野毒株、哈爾濱犬野毒株、某疫苗弱毒株、Onderstepoort弱毒株和海豹瘟熱病毒2型毒株的同源性分辨為92.2%和98.9%、92.5%和98.9%、91.5%和94.6%、92.9%和98.9%、98.2%和100%。這樣就進一步斷定了大熊貓的犬瘟熱病毒沾染[14]。

　　Zurbriggen等用地高辛標志Ｎ基因互補的特異性RNA探針具有高度敏感性，可查證單個感染細胞中存在的目標核酸序列，特異性較強，不發(fā)生背景[15]。Shin 等應用RT-PCR已能檢測出患狗外周血單核細胞中的犬瘟熱病毒的核衣殼蛋白基因 (N)及應用pRVSV載體勝利表達了CDV的N基因[16,17]。

　　目前，在獸醫(yī)臨床工作中，犬瘟熱的診斷多采取臨床診斷、包涵體檢討和ELISA法。對于病毒的分別、鑒定，免疫組化法和分子生物學等診斷方式，尚未推廣利用。


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