顯微鏡,顯微鏡價(jià)格,顯微鏡的價(jià)格

　　 【摘要】目標(biāo) 應(yīng)用低強(qiáng)度間斷負(fù)壓誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)向成骨細(xì)胞定向分化。方式 分別人骨髓，利用梯度離心法進(jìn)行MSCs的培育，取第三代細(xì)胞應(yīng)用低強(qiáng)度間斷負(fù)壓誘導(dǎo)分化;顛倒顯微鏡下視察細(xì)胞的形態(tài)，檢測(cè)堿性磷酸酶(ALP)活性，茜素紅染色察看鈣結(jié)節(jié)形成，免疫組織化學(xué)檢測(cè)Ⅰ型膠原和骨掩護(hù)素的表達(dá)。成果 低強(qiáng)度間斷負(fù)壓引誘2周后，細(xì)胞浮現(xiàn)出成骨細(xì)胞形態(tài)，ALP活性顯明加強(qiáng)，茜素紅染色可見鈣結(jié)節(jié)形成，Ⅰ型膠原和骨維護(hù)素表達(dá)陽性。結(jié)論 利用低強(qiáng)度間斷負(fù)壓可以勝利的誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞定向分化，誘導(dǎo)的細(xì)胞具有典范的成骨細(xì)胞特征。

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　　【要害詞】 負(fù)壓 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 成骨細(xì)胞 誘導(dǎo)

　　Low-intensity interrupted negative pressure induces human marrow mesenchymal stem cells differentiating into osteoblasts

　　Yang Zhi, Liu Miao, Zhang Yingang, Guo Xiong, Xu Peng

　　(1. Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital, Medical School ofXian Jiaotong University, Xian 710061; 2. Key Laboratory of Environment and Genes Related to

　　Diseases of Ministry of Education, Institute of Environmental and Endemic Diseases,Xian Jiaotong University, Xian 710061; 3. School of Materials Science and Engineering,Xian Jiaotong University, Xian 710049, China)

　　ABSTRACT: Objective To investigate the effect of low-intensity interrupted negative pressure on the differentiation of human marrow mesenchymal stem cells (MSCs) into osteoblast in vitro. Methods MSCs were isolated from adult marrow using density gradient separation method, passage 3 cells were chosen to induce differentiation; the differentiation of MSCs was examined by phase-contrast microscopy, the determination of alkaline phosphatase (ALP) activities, alizarin-red staining and the immunohistochemistry of typeⅠcollagen and osteoprotegerin. Results MSCs showed a typical appearance of osteoblasts after 2 weeks induction by low-intensity interrupted negative pressure, the activities of ALP were increased significantly, calcium nodes were seen by alizarin-red staining, the expressions of collagen typeⅠ and osteoprotegerin were positive. Conclusion Low-intensity interrupted negative pressure could successfully induce human MSCs into osteoblasts and the induced cells show characteristics of osteoblasts.

　　KEY WORDS: negative pressure; marrow mesenchymal stem cell; osteoblast; induction

　　近年來，負(fù)壓封閉引流技巧(vacaum assisted closure, VAC)在外科創(chuàng)面處置方面取得了宏大的勝利，該項(xiàng)技巧能改良創(chuàng)面血供增進(jìn)創(chuàng)面愈合測(cè)量顯微鏡。負(fù)壓技巧對(duì)骨組織有何作用以及作用的機(jī)制如何，能否用來增進(jìn)骨折愈合、治療骨壞逝世等方面，國(guó)內(nèi)外尚無學(xué)者對(duì)其進(jìn)行研討。本研討在預(yù)試驗(yàn)的基本上通過察看低強(qiáng)度間斷負(fù)壓對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)引誘分化的影響，以論述其作用機(jī)制，為今后在骨折愈合和骨壞逝世方面的研討供給理論根據(jù)。

　　1 資料與方式

　　1.1 資料

　　骨髓2例取自我科診斷為髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎，行人工關(guān)節(jié)置換的手術(shù)患者，年紀(jì)分辨為56歲和61歲。兩例患者肝腎功效正常，無代謝性骨病及沾染病，手術(shù)前經(jīng)患者批準(zhǔn)，術(shù)中截骨后經(jīng)骨髓腔抽取骨髓5mL，吸進(jìn)預(yù)先加有肝素的針筒備用。

　　1.2 主要試劑與儀器

　　L-DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶均為Gibco產(chǎn)品，Percoll分離液為Sigma產(chǎn)品(1.073 g/mL)，胎牛血清(杭州四季青)，Ⅰ型膠原和骨保護(hù)素免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，完整培養(yǎng)基的組成：L-DMEM培養(yǎng)基參加100 mL/L胎牛血清，測(cè)量顯微鏡，青、鏈霉素終濃度為100 u/mL，微型負(fù)壓儀。

　　1.3 細(xì)胞原代培養(yǎng)

　　細(xì)胞采取梯度離心法進(jìn)行培養(yǎng)：將抽取的骨髓分裝入離心管，參加 L-DMEM培養(yǎng)基2 mL，1 500 r/min離心5 min往除上層脂肪滴和上清，以D-Hanks液重懸細(xì)胞后平展于Percoll分別液上，1 500 r/min離心10 min，汲取中間層的白膜層(單核細(xì)胞層)，以D-Hanks液洗滌，加進(jìn)L-DMEM培養(yǎng)基置入無菌培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))的CO2孵育箱培養(yǎng)。

　　1.4 負(fù)壓誘導(dǎo)

　　取第三代細(xì)胞進(jìn)行負(fù)壓誘導(dǎo)，把24孔和6孔造就板中培養(yǎng)液預(yù)先吸掉4/5，打開蓋置進(jìn)自行設(shè)計(jì)的無菌密閉容器中，容器側(cè)面有孔和導(dǎo)管與微型負(fù)壓儀相連，打開負(fù)壓儀設(shè)置壓力為20 kPa，30 min/次，2次/d。每次誘導(dǎo)完畢后取出培養(yǎng)板補(bǔ)足培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)分為負(fù)壓誘導(dǎo)組和正常培養(yǎng)組。

　　1.5 細(xì)胞視察

　　顛倒顯微鏡下逐日察看細(xì)胞的生長(zhǎng)情形和形態(tài)特色，拍照記載。

　　1.6 堿性磷酸酶活性的測(cè)定

　　引誘2周后，兩組細(xì)胞用考馬斯亮蘭微板法測(cè)定每孔中細(xì)胞蛋白含量，采取堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)試劑盒測(cè)定細(xì)胞ALP活性，定量測(cè)定兩組細(xì)胞中均勻每毫克蛋白質(zhì)的ALP活性變更，比擬兩組的差別。

　　1.7 茜素紅染色

　　誘導(dǎo)2周后，倒掉培養(yǎng)液，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS沖刷3遍，茜素紅染色8 h，顯微鏡下視察陽性成果。

　　1.8 免疫組織化學(xué)檢測(cè)Ⅰ型膠原和骨維護(hù)素的表達(dá)

　　誘導(dǎo)2周后，細(xì)胞用40 g/L多聚甲醛固定20 min，進(jìn)行Ⅰ型膠原和骨掩護(hù)素免疫組織化學(xué)檢測(cè)，一抗為鼠抗人Ⅰ型膠原和骨維護(hù)素單克隆抗體，DAB顯色。

　　1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處置

　　利用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)剖析，成果用均數(shù)±尺度差( ±s)表現(xiàn)，以t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)剖析，P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2結(jié)果

　　2.1 顛倒相差顯微鏡所見的細(xì)胞形態(tài)的變更

　　用間斷負(fù)壓誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖速度略低于正常培養(yǎng)組細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)逐漸由梭型向多角型轉(zhuǎn)化，帶有數(shù)個(gè)崛起，數(shù)目和形態(tài)不定，10-14 d細(xì)胞融會(huì)成單層，2周后逐漸形成多個(gè)散在的致密島狀構(gòu)造，而正常培養(yǎng)組細(xì)胞的形態(tài)大部分為梭型。誘導(dǎo)成功后，細(xì)胞1周左右傳1代，可穩(wěn)固傳10代。

　　2.2 ALP活性的測(cè)定

　　誘導(dǎo)2周后，間斷負(fù)壓誘導(dǎo)組的細(xì)胞ALP活性為(15.68±1.97)u/g，正常培養(yǎng)組為(6.34±1.21)u/g，t檢驗(yàn)兩組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

　　2.3 茜素紅染色和Ⅰ型膠原及骨保護(hù)素的免疫組織化學(xué)檢測(cè)

　　負(fù)壓誘導(dǎo)2周后，茜素紅染色可見多個(gè)散在散布大小形態(tài)各異的不透明棕紅色鈣化結(jié)節(jié)(圖1A)。Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色負(fù)壓組細(xì)胞胞漿中呈現(xiàn)大批黃褐色顆粒，陽性反映(圖1B)，正常培養(yǎng)組陰性反響;骨保護(hù)素免疫組織化學(xué)染色顯示表達(dá)程度明顯進(jìn)步(圖1C)。

　　3討論

　　MSCs是骨髓中除造血干細(xì)胞以外的另一種干細(xì)胞，其起源穩(wěn)固、分別培養(yǎng)相對(duì)簡(jiǎn)略及具有多向分化的才能，因而成為近年來研究的熱門。同源MSCs不產(chǎn)生免疫排擠反映，取材便利，是組織工程骨種子細(xì)胞的良好選擇。由于MSCs是骨修復(fù)進(jìn)程中成骨祖細(xì)胞的重要起源，作者為了揭示負(fù)壓誘導(dǎo)對(duì)骨折、骨不連及骨壞逝世有何作用，首先從細(xì)胞角度研究負(fù)壓誘導(dǎo)對(duì)人MSCs分化的影響。本試驗(yàn)立足于國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于負(fù)壓封閉引流技術(shù)的實(shí)驗(yàn)研究及臨床利用的基本之上，實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中將含少量培育液的MSCs培養(yǎng)板放在無菌密閉負(fù)壓容器之中時(shí)，容器內(nèi)的負(fù)壓使細(xì)胞表面受到牽張應(yīng)力的同時(shí)，也導(dǎo)致細(xì)胞缺氧。作者斟酌高強(qiáng)度負(fù)壓條件下會(huì)導(dǎo)致MSCs細(xì)胞凋亡急劇增添，所以采取低強(qiáng)度間斷負(fù)壓進(jìn)行誘導(dǎo)造就。

　　作者以為負(fù)壓誘導(dǎo)對(duì)MSCs分化的影響重要是通過機(jī)械刺激和細(xì)胞缺氧兩種機(jī)制共同作用的結(jié)果，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞通道。實(shí)驗(yàn)過程中細(xì)胞表面受到牽張應(yīng)力的機(jī)械刺激。機(jī)械刺激是細(xì)胞在生物進(jìn)化過程中受到的Zui基礎(chǔ)刺激之一，恰當(dāng)?shù)牧W(xué)刺激可促進(jìn)其生長(zhǎng)分化。生物機(jī)械刺激是影響骨組織形成和分化的重要外源性因素，力學(xué)信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)從而啟動(dòng)和調(diào)節(jié)相干基因蛋白的表達(dá)散布支架。Aaron等相差顯微鏡對(duì)MSCs間斷施加機(jī)械刺激表明可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和骨成熟，Wiesmann等支架利用牽張應(yīng)力作用于MSCs 3周發(fā)明Ⅰ型膠原和骨銜接素表達(dá)加強(qiáng)，細(xì)胞有顯明礦化結(jié)節(jié)形成，Simmons等測(cè)量顯微鏡應(yīng)用牽張應(yīng)力與成骨性誘導(dǎo)劑復(fù)合干涉MSCs，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)礦化是對(duì)比組的2.3倍。細(xì)胞的基質(zhì)礦化和成骨性分化是通過ERK1/2信號(hào)介導(dǎo)。我們發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度間斷負(fù)壓可以使MSCsⅠ型膠原表達(dá)加強(qiáng)，進(jìn)而增進(jìn)了細(xì)胞的成骨分化;負(fù)壓誘導(dǎo)過程中，細(xì)胞在受到牽張應(yīng)力作用的同時(shí)還合并缺氧。Lennon等支架研究發(fā)明，低氧條件下培養(yǎng)大鼠MSCs能增長(zhǎng)其骨形成才能。HIF-1是調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)的核心轉(zhuǎn)錄因子，在機(jī)體的生理和病理過程中起要害性作用。低氧引起骨系細(xì)胞的功效變更主要通過HIF-1α來介導(dǎo)。HIF-1α及其下游基因VEGF表達(dá)增添，從而改良骨組織血供代償?shù)脱鯛顩r測(cè)量顯微鏡。Towler等支架以為在骨組織發(fā)育和塑型改建過程中HIF-1α具有促進(jìn)成骨細(xì)胞發(fā)育和分化的作用，晉升HIF-1α介導(dǎo)可以加速細(xì)胞的成骨作用促進(jìn)骨折修復(fù)。負(fù)壓誘導(dǎo)中HIF-1α和Ⅰ型膠原兩者之間應(yīng)當(dāng)有協(xié)同關(guān)系。Ⅰ型膠原的表達(dá)一方面與應(yīng)力刺激有關(guān)，另一方面可能通過HIF-1α來介導(dǎo)，這有待進(jìn)一步的研究。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)ALP是細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的主要標(biāo)記酶，是成骨細(xì)胞早期和中期分化的主要標(biāo)記，也是評(píng)價(jià)機(jī)體成骨活性和組織分化才能的特異性指標(biāo)。ALP的活性高下與成骨細(xì)胞分化呈正相干關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)間斷負(fù)壓誘導(dǎo)后MSCs的ALP活性比正常培養(yǎng)組明顯進(jìn)步，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;成骨細(xì)胞在鈣化條件下培養(yǎng)具有體外礦化這一特色，也是成骨細(xì)胞的一種標(biāo)記。本實(shí)驗(yàn)通過茜素紅染色，發(fā)明負(fù)壓誘導(dǎo)2周后可見多個(gè)散在散布大小形態(tài)各異的不透明棕紅色鈣化結(jié)節(jié)。楊林等[9]發(fā)現(xiàn)人MSCs向成骨細(xì)胞分化過程中骨保護(hù)素的表達(dá)逐漸進(jìn)步。本研究結(jié)果顯示間斷負(fù)壓誘導(dǎo)可以促進(jìn)MSCs對(duì)骨保護(hù)素的高表達(dá)，與其結(jié)論一致。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過間斷負(fù)壓誘導(dǎo)后的細(xì)胞為成骨細(xì)胞，進(jìn)一步證實(shí)分離培養(yǎng)的細(xì)胞為成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞MSCs。但是，本實(shí)驗(yàn)方式中機(jī)械刺激的生物信號(hào)和HIF-1α調(diào)控兩者結(jié)合作用的分子生物學(xué)機(jī)制尚須進(jìn)一步的研究。

　　我們通過間斷負(fù)壓勝利的誘導(dǎo)體外培育的人MSCs向成骨細(xì)胞分化，細(xì)胞可以穩(wěn)固傳代。一方面闡明人MSCs經(jīng)體外間斷負(fù)壓造就擴(kuò)增后可以得到相當(dāng)數(shù)目的成骨細(xì)胞，種植于具有良好生物相容性和可塑性的細(xì)胞構(gòu)造上，將為組織工程學(xué)修復(fù)骨或軟骨缺損供給更遼闊的起源;另一方面為我們進(jìn)行負(fù)壓誘導(dǎo)對(duì)骨折、骨不連及骨壞死影響的試驗(yàn)研究打下了良好的基本，為其盡早的服務(wù)于骨科臨床供給根據(jù)。

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　　[9]楊林，海涌，曲鐵兵，等. 骨保護(hù)素和骨掩護(hù)素配體在人骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化進(jìn)程中的表達(dá) [J]. 中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志, 2007, 13(5):339-341.


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