顯微鏡,顯微鏡價(jià)格,顯微鏡的價(jià)格

　　加入少量胰酶清洗，棄往后，加入胰酶2－3ml，培養(yǎng)箱內(nèi)放置3min左右，取出，加入培養(yǎng)液中和胰酶，輕輕吹打即可。

　　ECV－304培育條件同時(shí)。操作的時(shí)候步驟基礎(chǔ)雷同，只是參加胰酶消化的時(shí)光比Bel-7402稍微長(zhǎng)1－2min。

　　同樣是新手上路，被我弄逝世的細(xì)胞也不少。還盼望大家多指教。

　　我曾經(jīng)養(yǎng)過幾種細(xì)胞，包含卵巢癌的和宮頸癌、胰腺癌等，其中重點(diǎn)做的卵巢癌的細(xì)胞，扼要說一下。我所用的卵巢癌的細(xì)胞包含SKOV3、A2780、3AO、OVCAR3、HRA，幾種細(xì)胞的特征不完整一樣，但是我的傳代的步驟是基礎(chǔ)一致的：細(xì)胞生長(zhǎng)至80%會(huì)合時(shí)傳代，先倒掉培養(yǎng)液，加預(yù)先加好雙抗的生理鹽水或PBS 5-10ml（100ml培養(yǎng)瓶）后輕輕搖擺數(shù)次后倒掉，加0.25-0.35%的胰酶2ml，并使其散布均勻（這一點(diǎn)很主要，必定要注意工作臺(tái)是否平整，否則容易造成胰酶散布不均勻而細(xì)胞消化不同步），待細(xì)胞間隙變大時(shí)終止消化，加含10%血清的培養(yǎng)液（我用的是1640）4ml柔柔吹打，再依照需傳代的比例（1：2或1：3）補(bǔ)足培養(yǎng)液后分裝至2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中。若細(xì)胞碎片較多，可在消化后不倒掉胰酶直接加含血清的培養(yǎng)液吹打后500rpm離心5min，再用培養(yǎng)液重懸分瓶。消化所需的具體時(shí)間依細(xì)胞的種類和狀態(tài)而定，也和細(xì)胞的會(huì)合水平有關(guān)，一般是80%會(huì)合時(shí)Zui容易消化，若細(xì)胞長(zhǎng)得太滿，消化時(shí)光要恰當(dāng)延伸，必要時(shí)可以將培養(yǎng)瓶移至培養(yǎng)箱內(nèi)消化。另外，一次性培養(yǎng)瓶要比玻璃培養(yǎng)瓶所需的消化時(shí)間稍長(zhǎng)。

　　胰腺癌細(xì)胞我所養(yǎng)的是CAP，感到不太好伺候，尤其是傳代時(shí)很艱苦。我一般是在倒掉培育液后，加生理鹽水或PBS沖刷，而后加一次胰酶作用3-5分鐘，倒掉胰酶，再加2-3ml新的胰酶持續(xù)消化，這樣加兩次的后果好一些，但是吹打的時(shí)候還是很艱苦，總感到細(xì)胞的貼壁才能太強(qiáng)了，明明看見細(xì)胞已經(jīng)變圓了，可就是吹不下來?，F(xiàn)在想想可能在胰酶中加EDTA會(huì)好一些。

　　相比而言，還是HELA好養(yǎng)，細(xì)胞的狀況一直不錯(cuò)，而且消化時(shí)也很輕易。

　　養(yǎng)過好幾種細(xì)胞，不過還是B16養(yǎng)的時(shí)間Zui長(zhǎng)，心得領(lǐng)會(huì)也比擬多。說一下我的經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)。正如drake015 斑竹所言：細(xì)胞增殖快非常好養(yǎng)，但是要及時(shí)換液，否則也很容易逝世亡、或變形。我養(yǎng)的Zui好的時(shí)候，天天都在換液，兩三天就要消化傳代。我用的消化液一般是 消化用含EDTA的胰酶0.25%，個(gè)人感到后果比擬好一點(diǎn)。

　　消化步驟：吸出培養(yǎng)液，加入PBS洗滌（視培養(yǎng)瓶大小加入相應(yīng)的量，25CM加入1-2ML）而后加一次胰酶（25CM培養(yǎng)瓶加0.6ML）作用2-3分鐘，輕輕搖擺使均勻作用在細(xì)胞層面上。要一直在顯微鏡下視察，以防消化過火，等細(xì)胞從梭形變成橢圓形（或是棱角變鈍），原來連成片的細(xì)胞之間開端有小小的空間，細(xì)胞與細(xì)胞好象是一粒粒的，界線明白，這時(shí)是消化的Zui佳機(jī)會(huì)。（細(xì)胞的活氣Zui好，又非常容易吹打）加入培養(yǎng)液進(jìn)行吹打十幾次即可。

　　假如消化到細(xì)胞全體飄起來，就消化的稍微有點(diǎn)過了。假如細(xì)胞的形態(tài)還是老樣子，就消化的有點(diǎn)不足，吹打起來十分費(fèi)力，有大片的細(xì)胞就會(huì)貼在壁上，起不來，而且很不均勻。只好重新加胰酶消化。

　　還有就是細(xì)胞長(zhǎng)的比較密時(shí)，胰酶可以比平時(shí)多加一點(diǎn)，消化時(shí)間恰當(dāng)延伸。

　　怎么沒大有養(yǎng)CHO細(xì)胞的??？

　　我養(yǎng)的是CHO細(xì)胞，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。

　　1、培養(yǎng)液用的GIBCO的RPMI-1640。里面加10%小牛血清，青霉素+鏈霉素。消化時(shí)用0.25%胰酶。

　　2、我都是1640配養(yǎng)分液時(shí)現(xiàn)加血清和雙抗，血清分裝后直接由-20度到37度水浴箱中溶掉，沒發(fā)現(xiàn)血清有沉淀現(xiàn)象?？傮w積100ml的培養(yǎng)液：90ml1640+10ml牛血清+1ml雙抗，無其他物資了。培養(yǎng)進(jìn)程中沒發(fā)現(xiàn)有什么問題。

　　3、傳代時(shí)，先吸掉培養(yǎng)液，我都不用倒掉的辦法，怕由于瓶口而污染，都是慢慢吸管吸出的。然后培養(yǎng)液略微沖刷一下，加胰酶，顛倒顯微鏡下見80%細(xì)胞變圓后，吸出胰酶，培養(yǎng)液終止消化。吹打下細(xì)胞，按所需稀釋比例傳代。我現(xiàn)在的CHO細(xì)胞狀態(tài)不是很好，但是瘋長(zhǎng)，不知道為什么。所以每次傳代時(shí)，我都是留一滴足夠，差未幾能稀釋20倍了。不知哪個(gè)戰(zhàn)友也養(yǎng)CHO細(xì)胞，多交換。

　　我也來談?wù)凱C12和WHBLWQ有些不同 ,不知WHBLWQ 的是為分化還是分化型的.

　　細(xì)胞起源:上海藥物研討所. 分化型PC12.

　　傳代時(shí)首先參加1ml0.05%胰酶,輕晃,將細(xì)胞浸過后馬上倒出 ,可往除狀況不好的細(xì)胞,再加入1 ml胰酶,程度搖擺,保證胰酶與細(xì)胞均勻接觸,3-4min后肉眼可看到瓶底有膜狀細(xì)胞紛紜掉落,至瓶底無膜狀物時(shí)到入8-10ml1640(+10%NBCS)終止消化,倒入離心管,用1ml移液器奏樂70次左右(各人用力不一吹打次數(shù)有出進(jìn)),胎盼藍(lán)染色存活率>95,是個(gè)很好的措施!!!

　　用過0.25%胰酶,細(xì)胞大片浮起逝世亡率極高!!

　　當(dāng)用不同批次配的胰酶必定要做預(yù)試后在正式應(yīng)用.

　　我來說說FRTL－5細(xì)胞的培養(yǎng)：

　　在F-12培養(yǎng)基中加入5％小牛血清、10mU/ml TSH、10µg/ml胰島素、5µg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、10ng/ml生長(zhǎng)抑素、0.4ng/ml氫化可的松、10ng/ml甘氨酰－組胺酰－賴氨酸醋酸鹽，每100ml培養(yǎng)液加入1ml雙抗，用2

　　00ml培養(yǎng)瓶置CO2孵箱35℃培養(yǎng)。每4天換液一次。待細(xì)胞有80％融會(huì)時(shí)進(jìn)行傳代。大約7－10天傳一代。 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好、有80％融會(huì)的FRTL-5細(xì)胞棄培養(yǎng)液， 0.2％EDTA：0.25％胰蛋白酶1：3的消化液大約3ml加入200ml培養(yǎng)瓶中，待有大面積細(xì)胞脫落時(shí)，加入培養(yǎng)液終止消化。用吸管輕輕吹打幾下就可以成單細(xì)胞懸液。分裝入兩個(gè)培養(yǎng)瓶，傳代完成，中間不須要離心。假如過早中斷胰酶作用，很難吹打成單細(xì)胞懸液。

　?。ɑ讋?dòng)脈平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)）

　　1：培養(yǎng)液：MEM(GIBCO)，20％FBS，雙抗100IU／ml；

　　2：原代細(xì)胞培養(yǎng)：取5kg左右兔空氣栓塞法正法后斷頭，于無菌條件下從枕大孔處用大止血箝扳開顱骨裸露并警惕取出腦組織放入裝有DMEM的培養(yǎng)皿中，用眼科鑷分別基底動(dòng)脈后按慣例平滑肌方法貼塊培養(yǎng)。

　　3：傳代:我的步驟是

　　（1）吸除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液。（2）D-Hanks液沖刷2遍。（3）加入消化液少許，以能籠罩瓶底為限。（4）顛倒顯微鏡察看發(fā)明細(xì)胞胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大時(shí)，立即終止消化。（5）吸除消化液，向瓶底注進(jìn)D-Hanks液數(shù)毫升，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，把殘留消化液沖掉。（6）用吸管汲取培養(yǎng)液輕輕重復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液；首次傳代將原代細(xì)胞按1：1傳代，此后按1：3進(jìn)行傳代。（7）傳代后細(xì)胞放置在37℃，5%CO2孵育箱內(nèi)造就。

　　還請(qǐng)莫吝筆墨哦呵呵，只是想偷偷懶了：）

　　4：我在做細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的一些小經(jīng)驗(yàn)：

　　a：在超凈臺(tái)操作（廢液杠放入）前要用紫外燈照30MIN以上，75%酒精擦手

　　b：貼塊法要細(xì)胞貼壁好必定剪的夠碎（先把血管剪成小段再狂剪一頓），展開時(shí)要均勻的展開，聚在一起翻面時(shí)輕易沖掉。

　　c：做原代的時(shí)候從取材直到放進(jìn)孵箱都要嚴(yán)厲無菌操作，該換的管子還是換了，別省了根管子壞了一瓶細(xì)胞

　　d：原代培養(yǎng)FBS含量Zui好高些，原代很嬌貴的

　　我現(xiàn)在培養(yǎng)的細(xì)胞是人絨毛膜癌細(xì)胞株JAR。Zui初，用0.25%胰酶消化液傳代，細(xì)胞脫壁容易，但是，吹打細(xì)胞180次左右，也只有80％細(xì)胞是單個(gè)細(xì)胞，而且，易引起細(xì)胞機(jī)械性損傷。于是，我改良辦法?，F(xiàn)在，我的處置如下：棄舊培養(yǎng)液－－0.02％EDTA作用2分鐘－－棄EDTA－－0.1％胰酶作用30秒－－棄胰酶，持續(xù)消化2分鐘－－加培養(yǎng)液終止消化。一般吹打細(xì)胞30－40次，細(xì)胞根本為單個(gè)。

　　EDTA是一種化學(xué)螯合劑，重要作用主任已說。我要提示一下：EDTA作用不受血清克制，故消化后需徹底肅清，否則影響細(xì)胞生長(zhǎng)。建議可能的話離心一下

　　我來說一下小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7的消化及傳代，RAW264.7因是單核巨噬細(xì)胞其生物學(xué)特征就是貼壁特殊牢，普通的方式基本就不可能將它消化下來，這也是養(yǎng)這種細(xì)胞Zui頭痛的問題?，F(xiàn)將我的一點(diǎn)心得，簡(jiǎn)介如下：

　　消化液：0.5％胰酶、0.2％EDTA，試驗(yàn)前加溫到37度

　　以50ml培養(yǎng)瓶為例：1、細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，長(zhǎng)滿瓶底80％時(shí)，棄往培養(yǎng)液，加D-HANKS 漂洗 兩次；2. 加入含胰酶和EDTA的消化液1－2ml,消化37℃約2-5min，鏡下可見細(xì)胞基礎(chǔ)圓形回縮即中斷消化，棄消化液加D-HANKS 漂洗兩次；3.加入新培養(yǎng)液10ml復(fù)吹打混懸細(xì)胞，按須要分入 新的培養(yǎng)瓶；4. 入37℃5％CO2孵箱，幾小時(shí)后即可再貼壁 。

　　我來談?wù)勎茵B(yǎng)過的SK-BR-3（乳腺腺癌細(xì)胞系）的傳代方式：剛開端養(yǎng)SK-BR-3時(shí)，細(xì)胞狀態(tài)不是很好，貼壁也不均勻，于是開端想措施，斟酌是不是奏樂的不夠，或是傳得過多，或是其它的什么，后來發(fā)明的確如此，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況與傳代的辦法有很親密的接洽。

　　我的傳代方式是：

　　以50平方厘米造就瓶為例，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底70％－80％

　　1 吸除或倒掉瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)基。

　　2 PBS 5ml加入培養(yǎng)瓶，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，讓PBS流遍細(xì)胞表面，倒掉。

　　3 PBS 5ml加入培養(yǎng)瓶反復(fù)洗一次，倒掉。

　　4 加進(jìn)1ml胰蛋白酶消化液，輕輕動(dòng)搖培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面，然后置37度5％的二氧化碳造就箱放置5分鐘，在顯微鏡下察看，發(fā)明細(xì)胞脫壁、變圓即可。

　　5 加入含血清的培養(yǎng)基5ml中斷消化，汲取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，重復(fù)輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，確保所有的瓶底都要吹打到。

　　6 吸1/3至1/4的細(xì)胞懸液接種至新的培養(yǎng)瓶，然后加8ml的新的細(xì)胞培養(yǎng)基，置37度5％的二氧化碳培養(yǎng)箱完成傳代。

　　我來說說wish細(xì)胞的傳代。wish細(xì)胞是上皮細(xì)胞， 人羊膜 細(xì)胞 ，培養(yǎng)基我用的是Zui常見的1640（10％小牛血清，加雙抗）。

　　1細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶時(shí)既要傳代。我用胰酶和edta的混雜液消化。用D-Hank's液配制成0.25%的胰酶。edta的終濃度是0.02%。

　　2使用前37度預(yù)熱，每個(gè)25ml培養(yǎng)瓶加9滴的胰酶和edta混雜液，消化液的量可依據(jù)自己培養(yǎng)瓶的大小而定，原則就是能夠蓋滿瓶底。加入胰酶和edta混雜液以后，為使酶的活性Zui大，將培養(yǎng)瓶蓋擰緊后放回培養(yǎng)箱中，5分鐘左右即用含血清的培養(yǎng)基終止消化。如果在室溫情形下消化，時(shí)間相應(yīng)加長(zhǎng)，可以用手給培養(yǎng)瓶加溫，是消化液施展Zui大的作用。可以在顯微鏡下視察，當(dāng)細(xì)胞界線已十分明白，從梭形變圓，即已分別為單個(gè)細(xì)胞，且有少量細(xì)胞漂起，則要終止消化了。

　　3將消化液倒掉，用eagle液洗滌一次。然后倒掉。

　　4加少量1640，用吸管輕輕奏樂。

　　5吸1/3至1/4的細(xì)胞懸液接種至新的培養(yǎng)瓶，然后加8ml的新的細(xì)胞培養(yǎng)基，置37度5％的二氧化碳培養(yǎng)箱完成傳代。

　　說一下SACC（腺樣囊性癌細(xì)胞）的傳代。SACC比擬難消化，應(yīng)用37度預(yù)熱過的0.25%的胰酶一般消化5－8分鐘即可，在看到細(xì)胞成片脫落伍參加10％胎牛血清的培育液終止。巴氏吸管吹打均勻，計(jì)數(shù)后傳代。消化時(shí)一般不用EDTA，老板說對(duì)細(xì)胞損傷大，而且還要清洗幾次，麻煩。只要消化下來，SACC很輕易形成單細(xì)胞懸液。

　?。s略圖，點(diǎn)擊圖片鏈接看原圖）

　　說說昆蟲細(xì)胞Sf9細(xì)胞(一種昆蟲表達(dá)體系的宿主細(xì)胞)：

　　Sf9細(xì)胞生長(zhǎng)條件：27℃、無需CO2、既可懸浮生長(zhǎng)也可貼壁生長(zhǎng)、培養(yǎng)基SF-900Ⅱ（無血清）。懸浮培養(yǎng)時(shí)把細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)瓶中，要有轉(zhuǎn)動(dòng)裝置（若無上述裝置可把培養(yǎng)瓶放在小搖床上<200rpm搖振陪養(yǎng)）。貼壁培養(yǎng)時(shí)可把細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)瓶中直接靜置30-60分鐘即可貼壁，傳代時(shí)不用消化，用吸管輕輕吹打即可使細(xì)胞脫落下來，一般三天傳一次代。

　　就我個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，懸浮培養(yǎng)更便利，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)也不錯(cuò)。尤其對(duì)剛復(fù)蘇的細(xì)胞Zui好先進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿或須要細(xì)胞時(shí)，用吸管把細(xì)胞吸入離心管中，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘，然后棄掉上清，用手指將離心管中的細(xì)胞彈打均勻，加新培養(yǎng)基，吹打均勻即可分到另外一瓶中。本來瓶中可再加新培養(yǎng)基持續(xù)搖振陪養(yǎng)。

　　如需交換：[email protected]

　　我也來談?wù)勎茵B(yǎng)過的細(xì)胞消化的經(jīng)驗(yàn),我養(yǎng)過的貼壁細(xì)胞和半貼壁細(xì)胞有A549（肺腺癌細(xì)胞株,貼壁型）,NIH3T3(小鼠成纖維細(xì)胞,貼壁型),Ana-1(小鼠巨噬細(xì)胞,半貼壁型,普通的吹打可吹不下多數(shù)貼在壁的細(xì)胞喲).我應(yīng)用的消化液為0.25%胰酶（不加EDTA），消化前同前面大多數(shù)同仁一樣，37度溫浴一下消化液和培養(yǎng)基，酒精棉球插試后拿進(jìn)超凈臺(tái)。消化時(shí)先盡量將舊的培養(yǎng)液到盡，然后加一點(diǎn)胰酶消化液（量2-3mL）中和殘存的細(xì)胞液，輕輕晃動(dòng)幾下使四周壁上殘存的培養(yǎng)液都被消化液沖洗下來，到掉，再加入新穎的胰酶消化液，沒細(xì)致胞即可，往返輕輕晃動(dòng)，你會(huì)發(fā)現(xiàn)很快就能看清培養(yǎng)瓶細(xì)胞面有密布的針尖大小的點(diǎn)（憑你肉眼就能看到，那就是細(xì)胞，當(dāng)然一點(diǎn)并不是一個(gè)細(xì)胞，不知大家平時(shí)注意過沒有？），你不用拿到顯微鏡下察看，也不用估量時(shí)光，待輕輕晃動(dòng)就能沖下細(xì)胞培養(yǎng)瓶上的上面講到的針尖大小的點(diǎn)時(shí)，馬上再加入完整培養(yǎng)液終止消化（量是消化液的2-3倍即可，大約3-4mL），輕輕吹打一兩下即可轉(zhuǎn)移到離心管離心，奧林巴斯顯微鏡，棄上清,加入新穎的完整培養(yǎng)液制成懸液，按你的請(qǐng)求分到其它的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中即可。

　　此進(jìn)程均未分開超凈臺(tái)，也不用加PBS等沖洗，大大減少了污染的機(jī)遇，而且操作也簡(jiǎn)略，我養(yǎng)細(xì)胞還從未失過手（從未污染過以及因消化傳代細(xì)胞活氣不佳），不過要視力好喲。

　　我來說說組織塊無血清條件培養(yǎng)小鼠的顱神經(jīng)嵴細(xì)胞：

　　將小鼠顱段神經(jīng)管組織塊（第6體節(jié)前）經(jīng)0.75mg/ml膠原酶（152U/mg）換液消化3次，37℃20分鐘孵育后，輕吹打獲神經(jīng)管，膠原酶通過冷培養(yǎng)基重復(fù)置換。將神經(jīng)管組織塊置于經(jīng)Fn預(yù)孵的75MM培養(yǎng)瓶中（0.25mg/ml纖粘連蛋白抽干后，以條件培養(yǎng)基洗滌備用），37℃培養(yǎng)30分鐘后組織塊貼壁，加DMEM/F12無血清條件培養(yǎng)基。48小時(shí)后去除組織塊。2.5g／L胰蛋白酶慣例消化傳代。

　　無血清條件培養(yǎng)基的配方，在DMEM／F12無血清培養(yǎng)基中加入ITS (100mg／m1轉(zhuǎn)鐵蛋白、5mg／m1胰島素、30nmoL/L亞硒酸)、孕酮(20nmoL/L)、腐胺(16mg／m1)、地塞米松(39pg／ml)、油酸甘油酯(10ng／m1)、牛血清白蛋白(1mg／ml)、生物素(1mg／mI)、甘油(3.6mg／m1)、表皮生長(zhǎng)因子(100ng／m1)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(0.4ng／m1)

　　彌補(bǔ)解釋： 我做的試驗(yàn)是雌二醇對(duì)腺樣囊性癌細(xì)胞的增殖作用，所以要消除雌二醇（E2）對(duì)試驗(yàn)的干擾。按產(chǎn)品闡明書配制無酚紅RPMI－1640培養(yǎng)基。為肅清胎牛血清中的E2,按0.005g/ml劑量加入活性炭，37℃水浴2小時(shí)，過濾去除活性炭，56℃恒溫水浴箱滅活，然后配制含10％（V/V）胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。SACC（腺樣囊性癌細(xì)胞）致于37℃體積分?jǐn)?shù)為5％二氧化碳孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

　　請(qǐng)高手先容一下小鼠前胃癌細(xì)胞MFC的培養(yǎng)及傳代的經(jīng)驗(yàn)和所需注意的處所。不勝感謝！??！

　　我來談?wù)凥FF（小兒包皮細(xì)胞）的傳代:

　　棄培養(yǎng)液-->以無鈣鎂PBS液洗兩次（用酚紅做指導(dǎo)劑）使到達(dá)Zui佳消化PH值-->0.25％胰酶1-2ml（用酚紅做唆使劑）消化( T75 瓶)-->到掉胰酶-->放入37度培養(yǎng)箱-->5分鐘左右后鏡下視察細(xì)胞回縮變圓-->輕輕拍打下來->以完全培液（DMEM+10% FBS）終止反映->吹打成單個(gè)細(xì)胞，然后以1:2-1:3傳代。


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