顯微鏡,顯微鏡價(jià)格,顯微鏡的價(jià)格

　　【資源】常用細(xì)胞凋亡檢測方式

　　在試驗(yàn)中經(jīng)常須要檢測細(xì)胞的凋亡情形，下面我收集了一些常用的細(xì)胞凋亡檢測方法，盼望對大家有輔助！>一、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測1 光學(xué)顯微鏡和顛倒顯微鏡　　（1） 未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完全但呈現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細(xì)胞呈現(xiàn)皺縮、變圓、脫落?！　。?） 染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊沿化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典范的凋亡形態(tài)?！　? 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡　　一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變?yōu)橹笜?biāo)來評判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情形?！　〕Ｓ玫腄NA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三種種染料與DNA的結(jié)合是非嵌進(jìn)式的，重要聯(lián)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光?！　oechst是與DNA特異聯(lián)合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，應(yīng)用時(shí)用PBS稀釋，終濃度為10 ug/ml?！　API為半通透性，用于慣例固定細(xì)胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為10 ug/ml?！　〕晒u判：細(xì)胞凋亡進(jìn)程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)涌現(xiàn)濃縮狀況；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝集、邊沿化；Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊，發(fā)生凋亡小體(圖1)?！　? 透射電子顯微鏡視察　　結(jié)果評判：凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，涌現(xiàn)很多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡構(gòu)造(圖2)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝集、邊沿化；細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。 screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=593 height=595 title="Click to view full 1.jpg (593 X 595)" border=0 align=absmiddle>圖2－－－ （縮略圖，點(diǎn)擊圖片鏈接看原圖）二、磷脂酰絲氨酸外翻剖析（Annexin V法） 　　磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，裸露在細(xì)胞外環(huán)境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依附性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)志了的Annexin-V作為熒光探針，應(yīng)用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生?！　〉饣?propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完全的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和逝世細(xì)胞，PI能夠透細(xì)致胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配應(yīng)用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及逝世細(xì)胞區(qū)離開來?！　∞k法 　　1 懸浮細(xì)胞的染色：將正常培育和引誘凋亡的懸浮細(xì)胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，參加100ul Binding Buffer和FITC標(biāo)記的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室溫避光30min，再加進(jìn)PI（50ug/ml）5ul，避光反響5min后，參加400ul Binding Buffer，立即用FACScan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測（一般不超過1h）， 同時(shí)以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對比。　　2 貼壁造就的細(xì)胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗滌、染色和分析同懸浮細(xì)胞?！　? 爬片細(xì)胞染色：同上，Zui后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行察看?！　〕晒?[圖4、圖5]　　注意事項(xiàng) 　　1. 全部操作動作要盡量柔柔，勿用力奏樂細(xì)胞。　　2. 操作時(shí)注意避光，反映完畢后盡快在一小時(shí)內(nèi)檢測。 screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=387 height=235 title="Click to view full 3.jpg (387 X 235)" border=0 align=absmiddle>圖4－－ （縮略圖，點(diǎn)擊圖片鏈接看原圖）圖5－－ screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=616 height=647 title="Click to view full 5.jpg (616 X 647)" border=0 align=absmiddle>三、線粒體膜勢能的檢測 　　線粒體在細(xì)胞凋亡的進(jìn)程中起著樞紐作用，多種細(xì)胞凋亡刺激因子均可引誘不同的細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，而線粒體跨膜電位DYmt的降落，被以為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反映進(jìn)程中Zui早產(chǎn)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特點(diǎn)（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）呈現(xiàn)之前，一旦線粒體DYmt瓦解，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。　　線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的加強(qiáng)或削弱闡明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或下降?！　》绞剑簩⒄Ｅ嘤募?xì)胞和引誘凋亡的細(xì)胞參加應(yīng)用終濃度為Rhodamine 123（1mM）或終濃度為DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37°C平衡30min，流式細(xì)胞計(jì)檢測細(xì)胞的熒光強(qiáng)度?！　∽⒁馐马?xiàng)　　1． 始終堅(jiān)持平衡染液中pH值的一致性，由于pH值的變更將影響膜電位?！　?． 與染料到達(dá)平衡的細(xì)胞懸液中假如含有蛋白，他們將與部分染料結(jié)合，下降染料的濃度，引起假往極化。四、DN *** 斷化檢測 　　細(xì)胞凋亡時(shí)重要的生化特點(diǎn)是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的銜接處斷裂, 形成50~300kbp長的DNA大片斷, 或180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表示為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細(xì)胞經(jīng)處置后，采取慣例辦法分別提純DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細(xì)胞群中可視察到典范的DNA ladder。假如細(xì)胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）使DNA標(biāo)志，然落后行電泳和放射自顯影，察看凋亡細(xì)胞中DNA ladder的形成。　　1. 大分子染色體DN *** 段的測定細(xì)胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50~300kbp長的DNA大片斷。所有超過必定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度雷同。線性DNA的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時(shí)，即到達(dá)辨別力的極限。此時(shí)凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA，DNA像通過彎管一樣，以其一端指向電場一極而通過凝膠，這種遷移模式稱之為"爬行"。因此，細(xì)胞凋亡早期發(fā)生的50~300kbp長的DNA大片斷不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分別。通常采取脈沖電泳技巧可美滿地解決這一問題。這個(gè)方式是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當(dāng)電場方向轉(zhuǎn)變后，大的DNA分子便滯流在爬行管中，直至新的電場軸向重新定向后，才干持續(xù)向前移動。DNA分子量越大，這種重排所須要的時(shí)光就越長。當(dāng)DNA分子變換方向的時(shí)光小于電脈沖周期時(shí)，DNA就可以按其分子量大小離開。　　參考文獻(xiàn) Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039　　2． DNA Ladder 測定　　方法：收獲細(xì)胞（1′107）沉淀?細(xì)胞裂解液?13000rpm′5min, 收集上清?1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56°C，2h?蛋白酶K（2.5mg/ml）37°C，2h?1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積的冷無水乙醇沉淀DNA，4°C過夜?14000rpm′15min?Zui后將沉淀溶解在TE buffer中，加DNA Loading Buffer?1.2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色并照相?！　〕晒篬圖6]　　參考文獻(xiàn) Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507　　3． 凋亡細(xì)胞DNA含量的流式細(xì)胞計(jì)剖析　　方法：收集細(xì)胞?70%冷乙醇（in PBS）4°C固定過夜?PBS洗滌，1000rpm′10min?RNase A（0.5mg/ml）37°C消化30min?PI（50mg/ml）染色，室溫避光15min?FACScan剖析DNA亞二倍體的形成及細(xì)胞周期的變更?！　〗Y(jié)果：[圖8]　　4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)長處：敏感度高，合適于檢測少量樣本，小部分凋亡細(xì)胞。如臨床活組織檢測。 screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=442 height=368 title="Click to view full 6.jpg (442 X 368)" border=0 align=absmiddle>圖8－－ screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=640 height=262 title="Click to view full 7.jpg (917 X 376)" border=0 align=absmiddle>

　　五 TUNEL法 　　細(xì)胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而發(fā)生大批的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)志到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相聯(lián)合的研討辦法，對完全的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能正確地反映細(xì)胞凋亡典范的生物化學(xué)和形態(tài)特點(diǎn)，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培育的細(xì)胞和從組織中分別的細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)測定，并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的研討中被普遍采取。


本文地址:http://m.hkxccw.cn/news/1340.html
出自: 顯微鏡報(bào)價(jià)網(wǎng) 轉(zhuǎn)載時(shí)請標(biāo)明出處.