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　　《激光掃描共聚焦顯微鏡體系及其在細胞生物學中的利用》

　　摘要激光掃描共聚焦顯微鏡是近十年發(fā)展起來的醫(yī)學圖象分析儀器，現(xiàn)已普遍運用于熒光定量測量、共焦圖象分析、三維圖象重建、活細胞動力學參數(shù)監(jiān)測和胞間通信研究等方面。其性能為廣泛光學顯微鏡質的奔騰，是電子顯微鏡的一個彌補。本文以美國Meridian公司的ACASULTIMA312為例扼要先容了激光掃描共聚顯微鏡系統(tǒng)的結構，功效和生物學運用遠景。

　　要害詞激光；共聚焦顯微鏡；粘附細胞分析與篩選（ACAS）

　　TheLaserScanningConfocalMicroscopySystemanditsBiologicalApplications

　　ChenYaowen,LinJielong,LaiXiaoying,MeiPinchao

　　(ShantouUni.Med.College,CentralLab,ShantouGuangdong515031)

　　AhstractTheLaserScanningConfocalMicroscopyisanewmedicalimageanalysisinstrument,whichisdevelopedinthelastdecade.Nowitiswidelyappliedinsuchfieldsasfluorescentquantitativemeasurement,conpocalimageandlyusis,3-Dreconstruction,Kineticsignalmonitioringoflivingcell,cellcellcommunicationresearches,etc.Inthispaper,ACSAULTIMA312(MeridianCo,USA)istakenasanexampletointroducetheprincipleofconfocalmicroscopy,itsfunetionsandbiologicalapplications.

　　KeywordsLaserConfocalMicroscopyAdherentCellAnalysisandsorting(ACSA)

　　激光掃描共聚焦顯微鏡（LaserscanningConfocalMicroscopy，簡稱LSCM）是近代生物醫(yī)學圖象儀器的Zui主要發(fā)展之一，它是在熒光顯微鏡成象的基本上加裝激光掃描裝置，應用紫外光或可見光激發(fā)熒光探針，應用盤算機進行圖象處置，從而得到細胞或組織內部微細構造的熒光圖象，以及在亞細胞程度上察看諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號及細胞形態(tài)的變更。已普遍利用于細胞生物學、生理學、病理學、解剖學、胚胎學、免疫學和神經生物學等范疇[1、2、3]，對生物樣品進行定性、定量、定時和定位研討具有很大的優(yōu)勝性，為這些范疇新一代強有力的研究工具。

　　創(chuàng)立于1983年的美國Meridian公司，在90年代推出的“激光掃描共聚焦顯微鏡”這一項具有劃時期的義意的高科技產品，曾獲得美國“政府新產品獎”和兩次“高科技領先技術獎”，它能到達每秒120幅畫面的高速掃描激光共聚焦視察，可供給實時，真彩色的激光共聚焦原色圖象。我院Zui近引起的ACASuLTIMA312是Meridian公司Zui新的高科技產品，為同類儀器中檔次Zui高、功能Zui全的精密儀器?，F(xiàn)以該儀器為例先容激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)及其在細胞生物學中的運用。

　　1、激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理及組成

　　有關共聚焦顯微鏡的某些技術原理，早在1957年就已提出，二十年后由Brandengoff在高數(shù)值孔徑透鏡裝置上改裝勝利具有高清楚度的共聚焦顯微鏡CCD，1985年WijnaendtsVanResandt發(fā)表了第一篇有關激光掃描共聚焦顯微鏡在生物學中利用的文章，到了1987年，才發(fā)展成現(xiàn)在通常意義上的第一代激光掃描共聚焦顯微鏡。

　　激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理如圖1所示，激光器發(fā)出的激光束經過擴束透鏡和光束整形鏡，變成一束直徑較大的平行光束，長通分色反射鏡使光束偏轉90度，經過物鏡會聚在物鏡的焦點上，樣品中的熒光物資在激光的激發(fā)下發(fā)射沿各個方向的熒光，一部分熒光經過物鏡、長通分色反射鏡、聚焦透鏡、會聚在聚焦物鏡的焦點處，再通過焦點處的針孔，由檢測器接受。

　　從圖1中可以看出，只有在物鏡的焦平面上發(fā)出的熒光才夠達到檢測器，其它地位發(fā)出的光均不能過針孔。由于物鏡和會聚透鏡的焦點在同一光軸上，因而稱這種方法成像的顯微鏡為共聚焦顯微鏡為共聚顯微鏡。在成像進程中針孔起著要害作用，針孔直徑的大小不僅決議是以共聚焦掃描方式成像還是以廣泛學顯微鏡掃描方式成像，而且對圖像的對照度和辨別率有主要的影響。

　　ACASULTIMa312采取快速鏡掃描或臺階掃描對樣品逐點掃描成像，由于樣品中不同的掃描點始終在物鏡和會聚透鏡的光軸上，因而它以雷同的信噪比掃描全部樣品，掃描精度達0.1μm，掃描面積Zui大的為10cm×8cm，當激光逐點掃描樣品時，針孔后的光電倍增管也逐點獲得對應光點的共聚焦圖像，并將之轉化為數(shù)字信號傳輸至計算機，終極在屏幕上聚合成清楚的全部焦平面的共聚聚焦圖像。一個微動步進馬達把持栽物臺的升降，使焦平面依次位于標本的不同層面上，可以逐層獲得標原形應的光學橫斷面的圖像。這稱為“光學切片”。再應用計算機的圖像處置及三維重建軟件?？梢缘玫礁咔宄葋肀硎緲吮镜耐庑纹拭妫謾C動、直觀地進行形態(tài)學察看。

　　2、激光掃描共聚焦顯微鏡硬件和軟件系統(tǒng)

　　2.1ACASULTIMa312硬件及參數(shù)指標 激光光源：氬離子激光（50mW的紫外光、999mW的可見光），能同時/次序/分辨輸出紫外光和可見光，激發(fā)波長為351-364nm；488nm；514nm。 計算機系統(tǒng)：80586/133MHzPCI/80MBRAM/2000MBSCSI硬盤/150MBBernoulli盤驅動器/17’’大屏幕顯示器。 共聚焦系統(tǒng)：計算機主動把持光路準調節(jié)；盤算機節(jié)制孔徑校準；計算機調節(jié)孔徑大??；主動Z軸調節(jié)（Zui小0.1μm）。 光學探測體系：3個測窗式PMT采集熒光；1個CCD系統(tǒng)；12位的高速A/D轉換器。 圖像辨別率：圖像大小1535×1535；像素Zui小間隔：0.1μm；灰度為4096級。 掃描方法：快速鏡掃描DualScan臺階掃描；掃描精度0.1μm；掃描面積Zui大為10cm×8cm；掃描平面：XY和XZ和奇特點、線、面掃描。2.2激光掃描共聚焦顯微鏡軟件系統(tǒng)

　　ACASULTIMa312系統(tǒng)采取奇特設計的軟件將激光細胞儀與先進的盤算機技巧聯(lián)合，發(fā)生快速、高效、機動的操作體系，完備的數(shù)據(jù)采集、剖析與治理功效。基于生物醫(yī)學研討有如下的軟件。

　　ImageAnalyze—對于單色、比色和三色標志的二維熒光圖像的定量分析，可產生透射光圖像重疊，同時AutoImage可多個區(qū)域的自動掃描和熒光定量，以及雷同區(qū)域的時光次序掃描。 RatioAnalysis和Kinetics—測定細胞內的離子變更，可有點掃描、線掃描及圖像掃描三種測定情勢，以監(jiān)測各種速率的生物反映。 Cell?CellCommunicationandFRAP-相鄰細胞的FRAP分析。該軟件首先用可光淬滅特異的細胞熒光，然后在多個時光點掃描，此掃描可對單一區(qū)域或細胞的多個選擇區(qū)域，可發(fā)生透射光圖像并與其它圖像重疊。 CellList—儲存被選擇細胞的地位，即可自動對較大樣品進行掃描，又可產生較小樣品特異部位的網(wǎng)絡地位表，以進行自動的測量、篩選和反復測定。 CellSorting—ACAS具備如下四種分選方式： AblationSort:預選定義一個熒光閾值，然后對特定細胞殺傷。②CookieCutterSort在用戶定義的中心點四周切割Cookies。③QuickSort：對已定義的細胞表列，用Ablation或CookieCutter作分選。④ManualSort：直接使用鼠標把持載物臺位置及激光脈沖，并殺滅和分選細胞，進行細胞顯微外科，染色體切割和光隱阱等操作。 ConfocalImaging—共聚焦分析，可實現(xiàn)Z軸定量，三維立體圖像分析（包含SFP模仿熒光處置法，DP深度投影法和SP文體投影法），以及視點移動動畫。

　　3激光掃描共聚焦顯微鏡在細胞生物學中的應用

　　3.1定量熒光測量

　　ACAS可進行反復性極佳的低光探測及活細胞熒光定量分析。利用這一功能既可對單個細胞或細胞群的溶酶體，線粒體、DNA、RNA和受體分子含量、成份及散布進行定性及定量測定，還可測定諸如膜電位和配體聯(lián)合等生化反映水平。此外，還實用于高敏銳度快速的免疫熒光測定，這種定量可以正確監(jiān)測抗原表達，細胞聯(lián)合和殺傷及定量的形態(tài)學特征，以揭示諸如腫瘤相干抗原表達的準斷定位及定量信息。

　　3.2定量共聚焦圖像分析

　　借助于ACAS激光共焦系統(tǒng)，可以獲得生物樣品高反差、高辨別率、高敏銳度的二維圖像?？傻玫酵耆畹幕蚬潭ǖ募毎敖M織的系列及光切片，從而得到各層面的信息，三維重建后可以揭示亞細胞結構的空間關系。能測定細胞光學切片的物理、生物化學特征的變化，如DNA含量、RNA含量、分子擴散、胞內離子等，亦可以對這些動態(tài)變更進行正確的定性、定量、定時及定位分析。

　　3.3三維重組分析生物結構

　　ACAS使用SFP進行三維圖像重組，SFP將各光學切片的數(shù)據(jù)組合成一個真實的三維圖像，并可從任意角度察看，也可以借助轉變照明角度來突出其特點，發(fā)生更活潑真切的三維后果。

　　3.4動態(tài)熒光測定

　　Ca2+、pH及其它細胞內離子測定，應用ACAS能敏捷對樣品的點，線或二維圖像掃描，丈量單次、多次單色、雙發(fā)射和三發(fā)射光比率，使用諸如Indo-1、BCECF、Fluo-3等多種熒光探針對各種離子作定量剖析?？梢灾苯拥玫酱蠓肿拥臄U散速率，能定量測定細胞溶液中Ca2+對腫瘤啟動因子、生長因子及各種激素等刺激的反映，以及應用雙熒光探針Fluo-3和CNARF進行Ca2+和pH的同時測定。

　　3.5熒光光漂白恢復（FRAP）--活細胞的動力學參數(shù)

　　熒光光漂白恢復技巧借助高強度脈沖式激光照耀細胞某一區(qū)域，從而造成該區(qū)域熒光分子的光淬滅，該區(qū)域四周的非淬滅熒光分子將以必定速率向受照區(qū)域擴散，可通過低強度激光掃描探測此擴散速率。通過ACAS可直接丈量分子擴散率、恢復速度，并由此而揭示細胞構造及相干的機制。

　　3.6胞間通訊研究

　　動物細胞中由縫隙銜接介導的胞間通信被以為在細胞增殖和分化中起非常主要的作用。ACAS可用于測定相鄰植物和動物細胞之間細胞間通訊，丈量由細胞縫隙銜接介導的分子轉移，研討腫瘤啟動因子和生長因子對縫隙連接介導的胞間通信的克制作用，以及胞內Ca2+,PH和cAMP程度對縫隙銜接的調節(jié)作用。

　　3.7細胞膜流動性測定

　　ACAS設計了專用的軟件用于對細胞膜流動性進行定量和定性分析。熒光膜探針受到極化光線激發(fā)后，其發(fā)射光極性依附于熒光分子的旋轉，而這種有序的活動自由度依附于熒光分子四周的膜流動性，因此極性測量間接反應細胞膜流動性。這種膜流動性測定在膜的磷脂酸組成分析、藥物效應和作用位點，溫度反響測定和物種比擬等方面有重要作用。

　　3.8籠鎖—解籠鎖測定

　　很多重要的生涯物資都有其籠鎖化合物，在處于籠鎖狀況時，其功效被封閉，尼康顯微鏡，而一旦被特異波長的瞬間光照耀后，光活化解籠鎖，使其恢復原有活性和功能，在細胞的增值、分化等生物代謝進程中施展功能。利用ACAS可以人為節(jié)制這種瞬間光的照耀波長和時光，從而到達人為掌握多種生物活性產物和其它化合物在生物代謝中施展功能的時間和空間作用。

　　3.9粘附細胞分選

　　ACAS是目前唯一能對粘附細胞進行分別篩選的剖析細胞學儀器，它對培育皿底的粘附細胞有兩種分選辦法：（1）Coolie-CutterTM法，它是Meidian公司專利技術，首先將細胞貼壁培育在特制造就皿上，然后用高能量激光的欲選細胞四周切割成八角形幾何外形，而非選擇細胞則因在八角形之外而被往除，該分選方法特殊實用于選擇數(shù)目較少諸如突變細胞、轉移細胞和雜交瘤細胞，即使百萬分之一機率的也非常幻想。（2）激光打消法，該方式亦基于細胞形態(tài)及熒光特征，用高能量激光主動殺滅不須要的細胞，留下完全活細胞亞群持續(xù)造就，此方式特殊適于對數(shù)目較多細胞的選擇。

　　3.10細胞激光顯微外科及光陷阱技巧

　　借助ACAS可將激光當作“光子刀”應用，借此來完成諸如細胞膜瞬間穿孔、切除線粒體、溶酶體等細胞器、染色體切割、神經元崛起切除等一系列細胞外科手術。通過ACAS光陷阱操作來移動細胞的渺小顆粒和構造，該新技術普遍用于染色體、細胞器及細胞骨架的移動。

　　4、結語

　　激光掃描共聚焦顯微鏡是近十年發(fā)展起來的醫(yī)學圖像分析儀器，與傳統(tǒng)的光學顯微鏡相比，大大地進步了分辯率，能得到真正具有三維清晰度的原色圖象。并可探測某些低對照度或弱熒光樣品，通過目鏡直接視察各種生物樣品的弱自發(fā)熒光。能動態(tài)測量Ca2+、pH值，Na1+、Mg2+等影響細胞代謝的各種生理指標光源，對細胞動力學研究有側重要的意義。同時激光掃描共聚顯微鏡可以處理活的標本，不會對標本造成物理化學特性的損壞，更接近細胞生涯狀況參數(shù)測定?？梢娂す鈷呙韫簿劢癸@微鏡是廣泛顯微鏡上的質的奔騰，是電子顯微鏡的一個彌補，現(xiàn)已廣泛用于熒光定量測量，共焦圖像分析，三維圖像重建、活細胞動力學參數(shù)分析和胞間通訊研究等方面，在全部細胞生物學研究范疇有著遼闊的應用遠景。

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